長江中下游及云貴高原蘆葦居群的遺傳變異特征

胡思文 ，何汝嘉 ，周淇 ，王樹人 ，黃睿 ，曹新益 ，丁浩 ，曾巾，趙大勇 *

1. 河海大學/水文水資源與水利工程科學國家重點實驗室/河海大學全球變化與水循環國際聯合實驗室，江蘇 南京210098；2. 湖泊與環境國家重點實驗室/中國科學院南京地理與湖泊研究所，江蘇 南京 210008；3. 河海大學水利學科專業實驗教學中心，江蘇 南京210098

蘆葦（Phragmites australis），禾本科蘆葦屬多年生草本植物，分布廣泛，在濕地生態系統中承擔重要的生態功能。作為濕地生態系統中最常見的優勢種之一，蘆葦具有凈化水體的作用，也是水體生態系統中物流和能流的物質基礎，其較高的生產力可以被湖泊濕地中初級消費者利用，蘆葦的莖稈和地下莖可以防止沉積物流失和河岸腐蝕，能夠維持生態系統多樣性和環境穩定性（岑璐瑤等，2019；Saltonstall et al．，2016）。近年來，我國的一些蘆葦濕地出現了種群退化現象，當前，保護我國蘆葦的遺傳資源，探討不同生態型蘆葦的遺傳差異應當成為研究熱點。

不同生境中的蘆葦在長期進化、適應特異生境的過程中，產生了可遺傳的性狀差異，并隨繁衍演替形成了種間豐富的生態型（楊允菲等，1998）。由于不同地理區域蘆葦種群所處的環境差異較大，互有明顯界限，在水深、鹽度、水分、土壤等環境因子的作用下，蘆葦的基徑、株高、穗長等性狀會發生顯著變化。例如，新疆蘆葦在不同生境適應的過程中形成的多種生態型，在形態及營養結構器官上有著顯著差異（劉明智等，2011）。黃河三角洲的蘆葦根據生境的鹽分差異被分為4種生態型：淡水沼澤蘆葦、咸水沼澤蘆葦、低鹽草甸蘆葦和高鹽草甸蘆葦（趙可夫等，1998）。河西走廊地區不同生境的蘆葦根據形態、生理生化等特征被分為水生蘆葦、輕度鹽化草甸蘆葦、重度鹽化草甸蘆葦及沙丘蘆葦4個生態型（任東濤等，1992）。任東濤等（1994）結合前人數據及其實驗結果，采用主分量分析及模糊聚類的方法指出劃分蘆葦生態型的綜合指標體系包括形態、生態、遺傳代謝及抗逆性生理等4個方面。

表型可塑性和遺傳變異是植物適應異質性生境的重要策略，因此，同種植物的不同居群可根據外部形態與生理特征進行生態型的基本劃分，但僅著眼于表觀差異可能會低估或高估生態型的變異程度，形態相似的種群極容易被忽略（莊瑤等，2010）。Theunissen提出：植物不同生態型的基因差異是自然選擇下遺傳變異的結果（Theunissen，1997）?？梢娺z傳變異是不同生態型形成的基礎，隨著分子技術的發展，分子標記能夠為生態型的識別提供更為可靠、穩定的參考指標，越來越多的研究使用分子技術對蘆葦生態型進行更為細致的劃分。張淑萍（2001）以形態特征和遺傳變異為基礎，通過聚類分析將黃河下游典型濕地的蘆葦種群分為鹽生蘆葦、淡水蘆葦和巨型蘆葦。林文芳等（2007）使用ISSR和RAPD技術對河西走廊4種生態型蘆葦的遺傳相似度進行分析，進一步證實了4種生態型蘆葦由水生生境經鹽漬生境向沙丘生境逐漸演化的趨勢特點。目前關于蘆葦的研究已經有了良好的生態基礎，主要集中在蘆葦基礎理論的研究、蘆葦病蟲害的防治、蘆葦在環境保護中的應用以及蘆葦的開發利用（宋金枝等，2018）。但關于不同蘆葦居群遺傳差異的研究區域多集中于小空間尺度，如：黃河三角洲、河西走廊等鹽度梯度顯著的地區，或生境差異顯著的蘆葦居群，如：旱生蘆葦和水生蘆葦，以及形態差異顯著的蘆葦居群等。針對不同地理區域的淡水湖泊蘆葦的相關研究還比較少，且一些根據形態及地域生境差異劃分的生態型并沒有遺傳分化方面的證據。

葉綠體基因組（chloroplast DNA，cpDNA），是僅次于核基因組的第二大基因組，廣泛存在于植物葉綠體內（Zhou et al.，2014）。作為植物中一個獨立的細胞器，葉綠體擁有一套完整的基因組，基因含量較為保守、易于測序，且 cpDNA的一些特定非編碼區由于序列結構特點，極易發生突變（李健仔等，2002）。因此，cpDNA對于種間類群系統發育的研究有重要意義。rpl16基因屬于cpDNA非編碼區，具有高度的AT重復莖環變異和序列長度變異，相較于編碼區的基因片段進化速率更高，可為低分類群間的系統發育研究提供更多的信息。

空間上廣泛分離的生態型可以顯示出由基因確定的不同特征，并且局限于它們發生的地理區域，因為跨度較大的地理區域易形成具有高度異質性的生境，需要種群內基因型多樣化以提供足夠的變異類型來適應特定的自然條件，因此，遺傳變異是蘆葦適應異質環境的重要方法（顏忠誠，2001）。我國湖濱帶蘆葦居群廣布的淡水湖泊集中分布于長江中下游和云貴高原，且這兩個地理區域經度和緯度跨度都比較大（在年平均氣溫、降水、日照等氣候特征上有一定差異，具有一定的地理隔離），蘆葦居群易形成大幅度的生境差異，種群間遺傳多樣性可能較高，進而形成不同的生態型，因此，地理區域選取長江中下游和云貴高原，在淡水湖泊的蘆葦研究中具有一定的代表性。本研究以不同地理區域為劃分指標，通過分析蘆葦葉綠體基因組中的rpl16基因序列探討地理區域跨度較大的長江中下游和云貴高原共19個湖濱帶蘆葦居群的親緣關系、遺傳多樣性和遺傳結構，并分析了不同湖泊蘆葦的形態差異與遺傳差異的異同，以期在分子水平為不同地理區域蘆葦生態型的劃分提供遺傳分化方面的證據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗所有蘆葦樣品于2018年7－8月采自長江中下游平原淡水湖泊和云貴高原淡水湖泊中的規模較大的典型天然湖泊，長江中下游選?。痕蛾柡≒oyang Lake）、石臼湖（Shijiu Lake）、巢湖（Chaohu Lake）、長蕩湖（Changdang Lake）、淀山湖（Dianshan Lake）、滆湖（Gehu Lake）、高郵湖（Gaoyou Lake）、洪澤湖（Hongze Lake）、升金湖（Shengjin Lake）、太湖梅梁灣（Taihu Meiliang Bay）和陽澄湖（Yangcheng Lake），共12個蘆葦居群，32個個體；云貴高原選取：滇池（Dianchi Lake）、撫仙湖（Fuxian Lake）、毛板橋水庫（Maobanqiao Reservoir）、青山嘴水庫（Qingshanzui Reservoir）和陽宗海（Yangzong Lake），共7個蘆葦種群，23個個體。每個湖泊一個采樣點，其中巢湖、撫仙湖、滇池是比較重要的淡水湖泊，故設置了兩個采樣點。

樣點的樣地框定在10 m×10 m的只有蘆葦、或者蘆葦為絕對優勢植物種的方形樣地，且蘆葦密度每平方米大于5株，每個采樣點按照常規采樣方式選取生長狀態健康的數株蘆葦，用10 m卷尺量取記錄每株蘆葦基徑、株高、最大葉長、最大葉寬、中部節長和節數作為表型數據，每株蘆葦采集的葉片置于封口袋中，并于4 ℃保存運輸，蘆葦葉樣品帶回實驗室后保存于-20 ℃。

本研究所用樣品的信息編號及采樣點分布圖分別見表1和圖1。

表1 樣品來源信息Table 1 Information of the sample source

圖1 長江中下游及云貴高原蘆葦樣品分布圖Fig. 1 Distribution of sampling sites in the middle and lower reaches of the Yangtze River and the Yunnan-Guizhou Plateau

1.2 樣品DNA提取及PCR擴增

所有蘆葦樣品的總DNA采用HP Plant DNA Kit（D2485-01）試劑盒提取，提取前先用液氮充分研磨樣品，提取后于-20 ℃冰箱內保存，采用引物rpl16-F71（GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG）和 rpl16-R1661（CGTACCCATATTTTTCCACCA CGAC）擴增rpl16序列（龔曉潔，2009）。所有樣品rpl16基因的PCR反應均采用Ex Taq DNA聚合酶進行擴增，體系為25 μL。包括：0.25 μL TaKaRa Ex Taq （5 U·μL-1），2.5 μL 10·Buffer，4 μL dNTP Mixture，上下游引物（10 μmol·L-1）各 0.5 μL，0.8%瓊脂糖電泳檢測無降解的DNA模板1 μL，用ddH2O補充至25 μL。擴增程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖電泳檢測擴增產物，根據Marker確認產物片段大小，取明亮單一的目的片段條帶交由生物公司（南京金斯瑞生物科技有限公司）進行DNA測序和拼接。

1.3 數據分析

對測序獲得的序列在NCBI上進行Blast比對，確定為目的序列，并將序列上傳至Genbank獲取登錄號。使用 Clustalx 1.8軟件進行多序列的比對排列，采用MEGA 7進行居群間遺傳距離分析，并采用最大簡約法構建基于rpl16基因序列的系統發育樹，用啟發式搜索最簡約樹，Gaps/missing做完全缺失狀態處理，自展法（Bootstrap-method）檢驗系統發育樹進化枝的可靠程度，參數選擇Tree-Bisection-Regrafting （TBR）法，共循環1000次重復。利用DNAsp 6.0軟件計算居群總的核苷酸多樣性 Pi、單倍型多樣性 Hd以及單倍型統計（王成樹等，2002）。通過Arlequin軟件的AMOVA程序進行不同地理居群間和居群內的遺傳變異組成分析，及不同地理居群間分化系數 Fst，并根據 Fst計算基因流 Nm=0.25(1-Fst)·Fst-1（張曉蕓等，2018）。對不同湖泊蘆葦樣品的形態指標使用SPSS軟件進行單因素方差分析。

2 結果與討論

2.1 rpl16基因序列分析

本研究獲得了 55個蘆葦樣品的 rpl16基因序列，包含了內含子和兩翼外顯子以及部分編碼區，得到的長江中下游蘆葦樣品的Genbank登錄號為：MK648345-MK648367，云貴高原蘆葦樣品的Genbank登錄號為：MK648373-MK648395。樣品的rpl16基因序列片段的G+C含量平均為31.65%，明顯低于 A+T的平均含量：68.35%，這與一些文獻中非編碼區的A+T含量較高結果一致（李毳，2016；王寧等，1999）。經DNAsp 6.0檢測，序列對齊后空白/缺失位點79個，保守位點1110個，變異位點4個，簡約信息位點3個。通過序列比對發現，存在以堿基顛換為主的遺傳變異類型，同時還有一些位點存在堿基的缺失和插入。如：與長江中下游所有蘆葦樣品相比，云貴高原的所有蘆葦樣品均在第293－299位點發生缺失突變，且在第413和第421位點發生了顛換突變；毛板橋水庫和青山嘴水庫的蘆葦樣品在第340個位點發生顛換突變；淀山湖的一株蘆葦樣品在第777位點插入堿基T。同一湖泊采集的淹水和非淹水生境中的蘆葦樣品的rpl16序列無差異，可見地理隔離是造成不同蘆葦居群遺傳差異的主要原因，因此在后續的分析中不再將水淹條件作為考慮指標之一。

2.2 聚類分析

序列比對后，利用MEGA 7軟件基于rpl16基因序列重建了（MP）最簡約系統發育樹，并進行了不同地理區域蘆葦居群間的遺傳距離分析。

2.2.1 系統發育分析

序列比對后，利用MEGA 7基于rpl16基因序列重建最簡約系統發育樹（MP），分支上的數字表示自展支持率。由圖2可以看出，長江中下游的樣品被歸類為一個置信度為91%的大支，與云貴高原的蘆葦樣品區分開，其中鄱陽湖和滆湖樣品在支上的分布較分散，說明這兩個居群的蘆葦樣品間具有較高的分散性，而太湖梅梁灣、升金湖、洪澤湖、高郵湖、淀山湖、長蕩湖、巢湖和和石臼湖的蘆葦樣品均聚類在一起，說明這些居群樣品間的分散度較小。云貴高原的蘆葦樣品中，毛板橋和青山嘴水庫的蘆葦樣品被歸類為一個置信度為 68%的單獨亞支，結合序列堿基差異比對，推測與序列個別位點的突變有關。滇池、撫仙湖及陽宗海的每株蘆葦樣品各聚為一類的置信度達到 100%，且相同居群間樣品的分布均較為分散，可能是這3個地方的蘆葦進化時間較長，具有更高的遺傳可塑性，相對來說比較獨立所致，屬于同一地理區域的毛板橋和青山嘴水庫的蘆葦雖然單獨形成一個分支，但與其親緣關系仍較近，長江中下游的蘆葦樣品與其親緣關系較遠，可能是因為不同的地理位置形成了不同的生存環境，使蘆葦產生了基因水平的變異，并隨著居群的繁衍保留，從而形成了不同的地理生態型。總的來說，不同地理區域之間的蘆葦樣品在進化時間和系統發育上存在一定差異，以地理區域為區分指標，可將長江中下游和云貴高原的蘆葦居群分為兩個單系。

圖2 基于rpl16 序列重建的最簡約系統發育樹Fig. 2 Maximum parsimony tree reconstruction based on rpl16 sequence

2.2.2 遺傳距離分析

遺傳距離是用來衡量物種間或同一物種不同群體間遺傳分化的指標，可用來描述群體的遺傳結構和居群間的差異，一般認為群體分化時間越短，遺傳距離越?。S椰林，2002；李欣，2008）。利用 MEGA 7計算本研究樣品居群間的遺傳距離。長江中下游各居群間以及云貴高原的滇池、撫仙湖、陽宗海兩兩之間的遺傳距離較小，說明其有共同的祖先來源，且遺傳跨度較小，不再在表2中列出。

由表2可以看出，19個湖濱帶蘆葦居群間的遺傳距離在0.0009－0.0035之間，其中毛板橋居群與長江中下游各居群間的遺傳差異最大，相對遺傳距離為0.0034－0.0035；其次是青山嘴居群與長江中下游各居群間的相對遺傳距離：0.0026－0.0027。云貴高原的滇池居群、撫仙湖居群、陽宗海居群和毛板橋居群與青山嘴居群之間的遺傳差異最小，相對遺傳距離為0.0009。除毛板橋居群和青山嘴居群外，云貴高原各居群與長江中下游各居群間的遺傳距離均為 0.0017－0.0018。這些結果符合 Koppitz（1999）對全球蘆葦研究得出的結論：地理距離增加，克隆間的遺傳距離增加。本研究中毛板橋水庫和淀山湖蘆葦居群的地理距離最大，約為：2031 km?？偟姆治鰜碚f：同一地理生態型居群間的蘆葦遺傳跨度較小，沒有明顯的遺傳距離差異，不同地理區域居群間存在一定的差異，但差異不大。Nei et al.（1979）通過研究得出：同一物種在地理居群間遺傳距離變動在0－0.05之間，亞種間的遺傳距離在 0.02－0.2之間，種間遺傳距離變動在 0.013－0.052之間。因此，本研究中不同地理區域居群間蘆葦的變異仍在亞種到種間的變化范圍內。

2.3 遺傳多樣性與遺傳結構分析

2.3.1 遺傳多樣性分析

物種的遺傳多樣性是指種內個體之間或一個群體內不同遺傳變異的總和。大量理論和實驗研究表明，生物居群中遺傳變異的大小與其進化速率成正比，因此，遺傳多樣性可以揭示居群的進化歷史（沈浩等，2001）。本研究利用DNAsp 6.0軟件從居群的核苷酸多樣性（Pi）和單倍型多態性（Hd）分析 19個湖濱帶蘆葦居群的遺傳多樣性。結果表明：19個湖濱帶蘆葦居群共計4種單倍型，除云貴高原毛板橋居群的一株蘆葦單獨為一單倍型外，其余單倍型分類與聚類結果一致，不同地理居群間無共享單倍型，這符合常見的種群分布規律，即：不同大小的多個種群分布在不同區域，分隔開來的種群會獨立進化，突變產生新的單倍型，且新的單倍型在其他種群中不存在（徐剛標，2011）。Saltonstall（2003）、Lynch et al.（2002）研究得出：蘆葦每個葉綠體單倍型代表一種母系遺傳的譜系，可見不同的地理區域的蘆葦已經形成了不同的基因型。居群總核苷酸多樣性 Pi=0.00113，平均核苷酸差異數k=1.254，居群總單倍型多態性Hd=0.575，從不同地理居群來看，長江中下游居群核苷酸多樣性和單倍型多態性均為 0，云貴高原居群核苷酸多樣性Pi=0.00047，單倍型多態性Hd=0.466，遺傳多樣性水平較高，可能與其起源較早有關，積累了更多的變異，這一點與聚類分析結果一致。總的分析，不同地理區域的群體遺傳多樣性水平相差較大。

表2 不同蘆葦居群間的遺傳距離Table 2 Genetic distance between different Phragmites australis populations

2.3.2 遺傳結構分析

物種的遺傳結構是指居群間和居群內的遺傳變異在空間和時間上的分布特征和格局，是研究植物適應性、物種形成過程及其進化機制的重要基礎（何薇，2014）。將19個湖濱帶蘆葦居群根據地理位置分為長江中下游和云貴高原兩類，進行分子方差分析（AMOVE），由表3可得：53.54%的遺傳變異來自于不同地理居群間，46.46%的遺傳變異來自于同一地理居群間，計算遺傳差異指數Fst，居群總遺傳差異指數Fst=0.53537，長江中下游蘆葦居群的遺傳差異指數Fst=0.53724，基因流Nm=0.21534，云貴高原蘆葦居群的遺傳差異指數Fst=0.53278，基因流 Nm=0.21923，兩個地理區域居群間的基因流Nm均小于1，說明不同的地理格局會對種系的遺傳分化產生一定的影響，不同地理種群之間存在一定分歧，根據Buso et al.（2010）的研究結果：Nm小于1，說明居群間的遺傳分化較強烈。

表3 不同蘆葦居群間的分子方差分析（AMOVE）Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVE) between different Phragmites australis populations

2.4 形態差異與遺傳差異的異同

蘆葦的形態作為其表型特征，具有一定的變異性和穩定性，受到來自基因和環境兩方面的影響，由環境導致的形態變異稱之為“可塑性”，而基因差異也會導致形態差異。在采集蘆葦樣品時記錄了每株蘆葦的基徑、株高、最大葉長、最大葉寬、中部節長和節數作為表型數據，由于每一個湖泊采樣點的蘆葦分布都比較均勻，認為每個湖泊的蘆葦所處的環境變量一致，故取每個湖泊蘆葦樣品表型數據的平均值來探討形態差異與遺傳差異的異同。表4列出了不同湖泊蘆葦樣品的表型數據平均值，并對不同湖泊間蘆葦的形態變異程度使用SPSS軟件進行單因素方差分析。

根據不同湖泊蘆葦樣品的表型數據平均值及單因素方差分析，不同湖泊蘆葦在6個形態指標上差異顯著，差異程度依次是：最大葉寬＞最大葉長＞節數＞株高＞基徑＞中部節長。最大葉寬的差異主要體現在洪澤湖、滇池和青山嘴水庫的蘆葦樣品的最大葉寬明顯小于其他湖泊，同時洪澤湖和滇池的蘆葦樣品的基徑也明顯小于其他湖泊；最大葉長的差異表現為陽澄湖和撫仙湖的最大葉長顯著高于其他湖泊；淀山湖和太湖的蘆葦樣品的節數明顯多于其他湖泊；淀山湖和毛板橋水庫的蘆葦樣品株高較高；不同湖泊蘆葦樣品的中部節長也存在差異。總的來說，不同地理區域和同一地理區域的蘆葦存在均一定的形態差異，結合遺傳差異分析，本研究中蘆葦的的形態變異有一定的遺傳基礎，且在形態變異上“可塑性”的影響更大，但僅根據形態差異來劃分生態型具有片面性，“可塑性”和遺傳基礎對形態變異的貢獻比率也有待進一步研究。

表4 不同湖泊蘆葦樣品的表型數據平均值Table 4 Mean value of phenotypic data of Phragmites australis samples collected from different lakes

種群間的遺傳變異反映的是物種對不同生境的適應情況，種群的遺傳多樣性越高，其對不同生境的適應力越強，利用分子技術可以從微觀角度探索不同生境中的蘆葦遺傳分化的程度及進化關系。龔曉潔（2009）利用rpl16等基因證實了河西走廊4種生態型蘆葦的劃分，并從遺傳多樣性角度分析了4種生態型蘆葦的進化關系。何薇（2014）通過rpl16基因對中國各個省的櫻桃居群進行了遺傳多樣性和遺傳結構分析，討論了不同省櫻桃居群間的親緣關系。張儷文等（2018）結合了遺傳變異和生境鹽度分析得出黃河三角洲濱海地區蘆葦群體的遺傳多樣性與生境鹽度具有正相關關系。邱天（2018）從蘆葦的表型變異結合分子生態學的角度分析了小空間尺度上蘆葦的遺傳變異與表觀遺傳變異有顯著相關性。本研究利用分子技術，選取地理區域為我國淡水湖泊較為集中的長江中下游和云貴高原，提取采集蘆葦樣品的總DNA，經PCR擴增后測序得到cpDNA非編碼區的rpl16基因序列，并基于rpl16序列分析發現不同地理區域的蘆葦居群在序列堿基、親緣關系、遺傳距離和遺傳結構均存在一定差異，證明了兩種地理生態型蘆葦具有遺傳上的差異，且地理隔離可能是引起差異的主要原因。

3 結論

（1）本研究得到的55個蘆葦樣品的rpl16基因序列，遺傳變異類型主要是堿基的缺失和顛換，且長江中下游蘆葦居群基因水平上的變異程度較云貴高原的低。

（2）蘆葦居群的親緣關系和地理距離成負相關，長江中下游和云貴高原的蘆葦居群在發育樹上形成不同分支，且滇池、撫仙湖及陽宗海的蘆葦是較為古老的居群，居群間的遺傳距離在 0.0017－0.0035之間，和地理距離成正相關。

（3）不同地理區間的群落遺傳多樣性水平差異明顯，云貴高原居蘆葦居群的核苷酸多樣性Pi=0.00047，單倍型多態性Hd=0.466，顯著高于長江中下游Pi=0，Hd=0。分子方差分析（AMOVE）顯示：53.54%的遺傳變異來自于不同地理居群間，高于同一地理居群間的遺傳變異46.46%。兩個地理區域居群間的基因流Nm均小于1，居群間的遺傳分化較強烈。

（4）不同湖泊蘆葦在形態指標上差異顯著，差異程度依次是：最大葉寬＞最大葉長＞節數＞株高＞基徑＞中部節長，結合遺傳差異分析本研究中蘆葦的的形態變異有一定的遺傳基礎，且在形態變異上“可塑性”的影響更大，但僅根據形態差異來劃分生態型具有片面性，“可塑性”和遺傳基礎對形態變異的貢獻比率也有待進一步研究。