β-內酰胺酶抑制劑的研究進展

嚴 勉，匡楠楠，張鶴營，謝書宇，瞿 偉，潘源虎，袁宗輝

（國家獸藥殘留基準實驗室（HZAU），華中農業大學國家獸藥安全評價實驗室，武漢430070）

β-內酰胺類抗生素在治療多種臨床致病菌感染中發揮著重要作用，然而細菌耐藥性的出現使這類藥物失去抗菌活性，甚至是耐酶的碳青霉烯類抗菌藥也不斷出現耐藥菌［1-2］。β-內酰胺類抗生素耐藥的最主要機制是細菌產生β-內酰胺酶，該酶能與β-內酰胺類抗生素的β-內酰胺環上的羰基共價結合，使其水解、滅活。目前已知的β-內酰胺酶數量有300余種，根據Bush分類法，β-內酰胺酶以優選底物和抑制劑譜的不同分為4組。Ambler根據各自氨基酸同源性序列將其分為A、B、C、D 4類，其中A、C、D類的活性基團為絲氨酸，B類的活性基團為Zn2＋（表1）。目前臨床上應用的β-內酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦等通過與β-內酰胺酶發生作用，阻斷其對β-酰胺環的破壞，有效地對抗了細菌的耐藥性，然而β-內酰胺酶的多樣化及不利突變使上述三種抑制劑逐漸失去作用。近幾年來，基于競爭性抑制劑的設計理念，通過提高抑制劑與酶的親和力及復合物的穩定性進行活性藥物篩選，取得了很大的進展；同時新的酶失活機制報道也為新型抑制劑的設計提供新的思路［3-5］。就近五年來的基于β-內酰胺酶水解機制的β-內酰胺酶抑制劑設計合成及活性研究作一概述，以期為新型化合物的研發提供借鑒。

表1 β-內酰胺酶的分類［6-8］Tab 1 Classification of β -lactamase

1 A、C、D類β-內酰胺酶抑制劑

目前上市或在研藥物多為A、C、D類β-內酰胺酶抑制劑，按結構可劃分為青霉素和頭孢菌素類、青霉烯類、單環類、青霉烷砜類及非β-內酰胺環類等。

1.1 青霉素及頭孢菌素類似物 該類化合物的構效關系研究多集中于C-3／7位（頭孢菌素類）和C-3／6位（青霉素類）。Zhang等合成了一系列硫亞胺頭孢菌素類似物，此類化合物的3位取代基在與酶識別過程中起關鍵作用，構效關系表明以芳香類大基團連接亞胺，可增強對C類頭孢菌素酶和TEM-1的抑制活性，其中化合物1和2以2-吡啶取代連接C-7硫亞胺，對野生型枯草芽孢桿菌C類酶的抑制作用優于他唑巴坦，與頭孢拉定配伍，對MSSA（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus）和肺炎克雷伯菌的MIC值降低2～4倍［9］。Margherita等從6-氨基青霉烷酸合成氮雜環丁酮衍生物3，對沙門氏菌有微弱的抑制作用（MIC50＞64 μg／mL），對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MIC降低2～3 倍 （ 相 比 于 氨 芐 西 林）［10］。 S-649266（Cefiderocol）的C-6位取代與頭孢他啶一致，C-3位引入鄰苯二酚，進入細菌后可螯合三價鐵，使外界鐵離子不斷進入細胞內。該化合物對多種耐藥腸桿菌（含酶 KPC-、VIM-、IMP-）有效，甚至是含NDM-1大腸桿菌、肺炎克雷伯菌［11］，且對KPC-3酶較為穩定，相比于美羅培南，200 μM的濃度下水解速率減弱3倍［12］（圖1）。

圖1 青霉素和頭孢菌素類衍生物Fig 1 Derivatives of penicillin and cephalosporins

1.2 青霉素砜類 代表藥物有舒巴坦和他唑巴坦，它們能與β-內酰胺酶發生非共價結合形成Michaelis復合體，然后70位絲氨酸的羥基進攻抑制劑內酰胺環上的羰基，導致內酰胺環開環形成酰化產物，接著惡唑環開環生成酮衍生物，最后在130位Ser的作用下經過多步重排反應，生成了不可被水解的酶和β-內酰胺類抗生素的多種酰化產物，最終使酶失去活性。戊二酸單甲酯取代物SA2-13，可與SHV-1的某些氨基酸形成鹽橋，脫乙酰化速率比他唑巴坦低10倍左右［8］。PSR-3-226的末端羧酸以酰胺取代，能夠與KPC-2活性位點構成反式烯胺，可作為靶向KPC-2酶抑制劑［13］。通過分子模擬發現LN-1-255結構中的C-3位基團、C-2位基團及吡啶環與OXA-1穩定結合，疏水性苯環有利于和氨基酸Trp102及Met99的互作，能有效抑制D類酶（OXA-1、-10、-14、-17及碳青霉烯酶OXA-24／40）的活性［14］，其對OXA-48抑制活性明顯優于他唑巴坦（IC50＝3nM）（圖2）。

圖2 青霉砜類衍生物Fig 2 Penicilla-sulfone derivatives

1.3 青霉烯類（碳青霉烯類、氧青霉烯類） 該類化合物是一種兼具青霉素和頭孢菌素骨架結構的的廣譜抗菌藥，1位S原子以C／O取代，C2-C3引入雙鍵，以增強化合物的穩定性，代表藥物有亞胺培南和美羅培南（圖3）。此類活性化合物的篩選集中于青霉烯的6位雜環取代、碳青霉烯的3位巰基雜環取代及氧青霉烯的2位取代［8］。Miller等以叔丁基取代C-2位，以不同的烷烯基取代氧青霉烯C-6位篩選活性化合物，C-6位共軛雙鍵是對靶酶特異性識別的關鍵結構位點（尤其是A類酶）。取代基類型和構像對酶的抑制活性同樣重要，其中化合物4和5呈廣譜抗菌作用，但光及水解穩定性有待解決［15］。

圖3 青霉烯類衍生物及其對β-內酰胺酶抑制活性Fig 3 Penicillene derivatives and their inhibitory activity to beta-lactamase

1.4 非β-內酰胺環抑制劑 該類化合物無典型的內酰胺環結構，通過模擬酶與底物（抗菌藥）的作用位點，與酶活性位點發生競爭性互作而呈現抗菌作用，包括二氮雜二環辛烷（DBOs）、硼酸類和無特定結構的其他化合物。

1.4.1 二氮雜二環辛烷 （DBOs） 阿維巴坦（Avibactam，AVI，圖4）是首個進入臨床研究的二氮雜二環辛烷（DBOs）非β-內酰胺環抑制劑，該藥與頭孢他啶組成的復方制劑已在FDA批準上市。MK-7655作用機制與其相似，結構上以吡啶連接酰胺的NH2，與亞胺培南和西司他汀合用已進入三期臨床研究。OP0595是在AVI的2位酰胺NH上連接氨乙氧基，這種烷氨基側鏈并不能增強其與酶活性口袋的相互作用，但可能與后者底端存在疏水作用，因此其對A類酶（TEM-、CTX-Ms、KPC-2）的抑制活性與阿維巴坦相近，對C類酶的抑制活性較好（AmpC、CMY-2），與哌拉西林、頭孢吡肟、氨曲南呈現協同作用［16］。該化合物單用無活性，和頭孢吡肟合用對大腸桿菌CTX-M-15和肺炎克雷伯菌KPC-有效［17］，還可抑制腸桿菌科的青霉素結合蛋白PBP2，有學者認為在研究阿維巴坦類似物活性時，這種抑制作用不容忽略［16，18］。

目前，DBO類似物的結構修飾集中在C-2和N-6位（圖4），辛烷的的R1分別以N-環丙基甲氧基甲酰胺、卡巴肼取代、得化合物6和7，兩者對TEM-1 和 AmpC 的 IC50均小于 0.1 μM，前者對OXA-2 的活性（1μM）優于后者（≥10 μM）［19］。

1.4.2 硼酸類似物 與經典的水解機制不同，硼原子作為親電體模擬β-內酰胺環的羰基碳，與酶的絲氨酸催化位點形成可逆的四面絡合物，這種共價結合物與傳統機制中過渡態結構類似（圖5）［20］。

圖4 二氮雜二環辛烷（DBOs）類衍生物Fig 4 DBOs derivatives

圖5 硼酸類衍生物Fig 5 Boric acid derivatives

化合物8的3位引入極性羧酸側鏈，可與TEM-1（Arg244和 Ser235），AmpC（Asn346 和 Asn289）及CTX-M-9（Arg276）關鍵氨基酸作用，增強結合親和力，擴大廣譜作用譜。基于此項研究，Donatella等合成了化合物9，其對TEM-1和CTX-M-9的活性可增強1250倍，但穩定性有待解決［21］。Caselli等以三唑環連接C-2，對C類酶呈現較好的親和力和抑制活性，其中化合物10和11活性最好，化合物10與三種 C類酶（AmpC、PDC-3和P99）的互作氨基酸高度保守，以 4 μg／mL 的濃度可恢復頭孢噻肟對大腸桿菌的活性（PDC-3和P99）［20］。

研究發現硼酸類化合物與TEM-1復合物中存在環化硼酸酯結構，Hecker等設計合成了一系列硼酸酯類化合物，分別以脂肪族、芳香族及氮雜環取代R基團（圖6）。 RTX7009（vaborbactam）以噻吩連接氨基（圖6），對A和C酶的Ki值可達nM級。該化合物單用無活性，與頭孢吡肟合用可對多種耐藥菌有效，且無明顯毒性［22］，與比阿培南配伍對產KPC酶的耐藥腸桿菌有效［23］。另一類硼酸酯類化合物12結構中引入雜環，與AmpC增加氫鍵互作，苯環上雙甲基與OXA-10疏水氨基酸互補，恢復頭孢他啶對含酶的大腸桿菌和枸櫞酸桿菌敏感性［24］。

圖6 硼酸酯類衍生物Fig 6 Borate ester derivatives

1.5 其他A、C、D類β-內酰胺酶抑制劑 O-芳基羧酸酯異羥肟酸是針對靶向DD-肽酶活性位點而設計的化合物，因C類β-內酰胺酶與后者的活性位點關鍵氨基酸相似，Tilvawala等合成了羥胺衍生物13（圖7），該化合物與P99酶發生快速乙酰化的過程中離去苯氧基團而保留酰基羥胺與C類酶的Ser64共價結合，其側鏈極性基團羧酸和氨基與活性位點附近 Ω loop（Gly320、Ser212和Arg204）發生有利互作形成穩定的過渡中間態使其脫乙酰過程減慢。酰化酶與絲氨酸的Ω loop間的這種互作結合可為新型抑制劑設計提供新思路［25］。Tan等合成了噻吩肟磷酸酯衍生物14和15，其磷酸基團與絲氨酸酶形成共價復合物，對 C酶（P99和AmpC）的活性最佳，與亞胺培南合用對產AmpC的綠膿桿菌呈劑量依賴型作用，對A和D酶的作用相對較弱［26］。

圖7 其他絲氨酸酶抑制劑Fig 7 Other serinase inhibitors

四唑類化合物是基于CTX-M內酰胺酶兩個研究熱點—Pro167的疏水作用和Asp240極性末端設計一種新的非共價結合的化合物，其作用與傳統β-內酰胺類抗生素的C-（3）4'位羧酸一致，化合物16（圖7）在苯環上引入疏水基團 CF3增加對Pro167的親和力，苯并咪唑作為氫鍵供體與Asp240互作，使其對大腸桿菌CTX-M-9的親和力顯著提高（Ki＝89 nM），與頭孢噻肟聯用恢復其對（CTX-M-9）的敏感性，MIC 降低64 倍［27］。

2 B類β-內酰胺酶抑制劑

B類β-內酰胺酶抑制劑多為鋅離子結合劑，其選擇性和耐受性問題在于Zn2＋螯合作用和酶活性位點氨基酸與其他含鋅蛋白酶的差異性，因此活性研究需區分金屬離子螯合作用和配體-酶復合物的形成作用［28］。

2.1 硫醇類化合物 該類化合物主要通過硫醇絡合Zn2＋發揮作用。Arjomandi等將氨基酸（Phe、Trp、Tyr）與硫醇化合物連接合成一系列衍生物，根據酶動力學結果篩選出化合物17，與亞胺培南合用對含IMP-1大腸桿菌、含IMP-4的陰溝腸桿菌的MIC 值分別降低5.2、3.9 倍（0.38 μg／mL），且以短鏈連接時活性較好（Ki＝0.086 μM）［29］。 Liu 等將氨基酸連接于噻吩和巰基乙酸之間合成硫酯化合物18，可選擇性作用于L1酶，其中化合物19和20與L1的作用方式相同［30］，而以4-聯苯取代噻吩環，抑制活性更好［31］（圖 8）。

圖8 硫醇類衍生物Fig 8 Mercaptan derivatives

2.2 三唑硫代乙酰胺 Zhang等設計了18種硫代乙酰胺類似物，分別對骨架21（圖9）的R1和R2進行修飾，所有化合物對嗜麥芽窄食單胞菌金屬酶L1（Ki＜2 μm）有效，部分作為廣譜抑制劑對四種受試酶 CcrA、NDM-1、ImiS、L1皆有效，其中化合物22優先通過三唑基團定位到Zn2＋，2位羥基與活性位點氨基酸殘基 Lys224（CcrA、NDM-1和ImiS）或Ser221（L1）結合（廣譜抗菌的原因），對四種酶的 Ki值可達到 0.30 ±0.09、0.43 ±0.03、2.2 ±0.2、0.073 ±0.007 μM［32］，R1 以芳香族羧酸取代可提高對ImiS的活性，如化合物23，Ki值為1.2 μM［33］；R2 芳香環4 位取代物活性優于 2 位取代，如化合物24，左側芳香環上氨基則與NDM-1的 Lys 211 互作，Ki為0.49 μM［34］（圖9）。

圖9 三唑硫代乙酰胺衍生物Fig 9 Triazole thioacetamide derivatives

2.3 金屬絡合劑 這類化合物通過絡合金屬酶活性位點Zn2＋發揮抑制作用，主要包括羧酸類和氮雜環化合物（圖10）。EDTA可抑制NDM-1的活性（IC50＝1.6 μM）［35］，但存在毒性作用。 近年來研究的新化合物 NOTA、DOTA、NODAGA、ME1071等（圖 10）能與碳青霉烯類合用，起到增敏作用［36-38］。其中NODAGA的1位末端羧基分別以四肽和八肽連接，增效作用最佳，化合物TPEN對Zn2＋的親和作用優于DPA，但細胞的氧化應激毒性作用存在弊端［36］。咪唑衍生物5-甲基-2-苯氧甲-3-H-咪唑-4-羧酸（PIMA）結構與青霉素V相似，可螯合鋅和鐵離子［39］。目前，大環羧酸類對鋅離子的親和性及安全性較好，臨床開發價值較高，但對靶酶選擇性問題尚待解決。

圖10 金屬絡合劑Fig 10 Metal complexing agent

2.4 多肽類 Caitlyn等合成了一系列含精氨酸的肽類，可作為選擇性抑制劑對酶-底物復合物具有較高的親和力，通過引發酶的聚合反應抑制其活性。該抑制劑活性主要受精氨酸數量及N端氨基酸類型的影響，對VIM-2的抑制活性可達到nM級，明顯優于IMP-1［40］。Xiao等基于金屬酶 VIM-2活性位點兩個loop環（Phe42-Ala45和Ile180-Trp199）的定位和識別作用，從組合肽數據庫篩選出三肽甲硫酰胺-半胱酰胺-色氨酸（25）和酪酰胺-半胱酰胺-色氨酸（26），IC50分別為18.15 μM 和 52.9 μM）（圖 11），分子對接中半胱氨酸巰基對金屬的螯合作用不同導致其抑制活性存在差異性，前者甲硫氨酸氨基與Asp193形成氫鍵，使loop環更加穩定，抑制活性更好［41］。

圖11 三肽類化合物化學結構Fig 11 Chemical structure of three peptide compounds

2.5 其他金屬酶抑制劑 Christopeit等首次報道對NDM-1有效且可逆的共價非β-內酰胺環化合物27，Ki值為 76 μM （圖 12），其醛基與 Lys224末端氨基形成共價復合物，色酮羰基氧與Zn2＋互作，同時與Trp87、Ile35和Val67存在疏水作用力。這種作用機制為β-內酰胺酶抑制劑的設計提供新的思路，但醛基相對不穩定，故有待優化。Mark等合成了一系列N-甲巰基衍生物，不含羧基或磺酸基等可電離基團，對NDM-1和VIM-1的Ki值在25～0.03 μM，多數化合物對結核桿菌有效，其中化合物28和29對多種酶呈現抑制作用［42］。Yang等設計合成化合物β-內磷酸環衍生物化合物28，對IMP-1，CcrA，L1，NDM-1 和Bla2 有抑制作用。化合物30磷酸中一個氧原子結合Zn1，N1結合Zn2，C-7位羧酸與金屬酶的Lys224側鏈形成鹽橋（L1除外）。

圖12 其他金屬酶抑制劑Fig 12 Other metalloenzyme inhibitors

3 展 望

β-內酰胺類抗生素在抗感染領域發揮著重要的作用，而耐藥菌的增多使該類抗生素在臨床上的應用大打折扣，所以新型β-內酰胺酶抑制劑不斷開發和應用已是抵抗該類細菌耐藥性的主要方法。目前，新型β-內酰胺酶抑制劑研究無論是基于片段設計，還是對已有化合物的結構修飾研究，都多通過與靶酶的酶抑動力學及抑制活性評價初步篩選候選物，再以共晶和體外抗菌活性測定，結合細胞毒性數據，對化合物進行綜合評定。近年來，基于酶關鍵作用氨基酸的活性化合物篩選取得了一定進展，如金屬酶VIM-2的兩個loop環及CTXMs酶的Pro167和Asp240等，能夠與這些氨基酸形成穩定的中間態是活性化合物篩選重要條件。由于金屬酶多具有廣譜水解作用，空間結構及水解機制相似，對相同活性位點氨基酸展開針對性的互作研究有助于廣譜抑制劑的篩選，如Lys224、Cys221等。雖然目前臨床上未見對四種β-內酰胺酶有效的化合物，但依據各類化合物對靶酶的選擇性來進行合理的配伍，不失為一種理想的應對策略，有研究表明阿維巴坦／頭孢他唑與氨曲南合用對MβL耐藥腸桿菌有效，甚至是含NDM-1和其他類酶的耐藥菌。耐藥突變及耐藥基因的傳播也是當然無法完全避免的關鍵問題，因此開發出對野生型及突變體同樣有效的抑制劑，從源頭上減緩耐藥性的產生也是今后研究的一大趨勢。