復方芩蘭口服液長期毒性試驗研究

2019-08-22 08:04:36魏麗娟耿志霞瞿紅穎宋婷婷魏占勇史萬玉

中國獸藥雜志 2019年7期

關鍵詞：劑量

賈興，劉欣，魏麗娟，耿志霞，瞿紅穎，宋婷婷，劉靜，魏占勇，史萬玉

（1.河北遠征藥業有限公司，石家莊050041；2.河北省獸藥工程技術研究中心，石家莊050041；3.河北農業大學，保定071000）

復方芩藍口服液為純中藥制劑，由金銀花、黃芩、連翹、板藍根四味中藥組成，用于外感風熱引起的發熱、咳嗽、咽痛［1-3］。為了考察復方芩蘭口服液臨床上長時間應用的安全性，對該制劑進行了長期毒性試驗研究［4］。本試驗通過將復方芩蘭口服液在一定時間內連續高劑量給試驗動物反復飲喂，觀察動物出現損害的靶組織或靶器官及劑量效應關系，并了解試驗動物對復方芩蘭口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評價復方芩蘭口服液能否安全應用于臨床提供科學依據，以保證用藥安全。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 3周齡清潔級Wistar大鼠80只，雌雄各半，購自斯貝福（北京）生物科技有限公司（許可證號SCXK（京）2016-0002）。大鼠購入后觀察飼養一周，投入試驗。

1.2 主要藥物及試劑復方芩蘭口服液：河北遠征藥業有限公司生產的中試產品（每mL相當于原生藥 1.25 g，批號：170701）。

天門冬氨酸氨基轉移酶試劑盒（產品批號20161108）、丙氨酸氨基轉移酶試劑盒（產品批號20161028）、肌酐試劑盒（產品批號 20161205）、血清白蛋白測定試劑盒（產品批號20161205）、總膽固醇測定試劑盒（產品批號20161108）、甘油三酯試劑盒（產品批號20161205）等購于南京建成生物技術有限公司，尿素氮試劑盒（產品批號201611125）、血糖測定試劑盒（產品批號20161125）等購于北京百智生物科技有限公司，總蛋白測定試劑盒（產品批號20161020）購自于美國Thermo公司。

1.3 主要儀器設備 BC-2800Vet獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司）；半自動生化分析儀（荷蘭圖威技術有限公司）；全波長酶標儀（美國 BioTek公司制造）；OLYMPUS生物顯微鏡（日本制造）；KD-202輪轉式切片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；電子天平，型號：Precisa 92SM-202A。

1.4 試驗動物及給藥方法選擇為了全面評價受試藥物復方芩蘭口服液的長期毒性，進行為期4周飼喂試驗（由于本制劑臨床擬推薦用藥期為5～7 d）；給藥方法理應灌胃給藥，但考慮到長達28 d的灌胃可能會造成大鼠食道及胃的損傷，也可能引起應激反應，進而影響試驗結果；而經前期的預試驗得到復方芩蘭口服液在大鼠飲水中加到8%（即80 mL／L）時，不會影響大鼠飲水量，且此劑量能滿足長期毒性試驗的劑量要求，故確定以飲水方式給藥，最大劑量定為80 mL／L（即擬推薦劑量的40倍）。

1.5 試驗分組體重（75±5）g Wistar大鼠80只，雌雄各半，隨機選擇分為4組（3個受試藥物不同劑量組與1個不用藥對照組），每組雌雄各10只。完成隨機分組后，對每組大鼠用結晶紫在不同部位進行染色編號標記。分籠飼養。

1.6 試驗劑量及給藥方式試驗設置高、中、低三個劑量以及一個空白對照組，其中高劑量組為含8%復方芩蘭口服液的飲水（即80 mL／L為擬推薦用量的40倍）；中劑量組為含4%復方芩蘭口服液的飲水（即40 mL／L為擬推薦用量的20倍）；低劑量組為含2%復方芩蘭口服液的飲水（即20 mL／L為擬推薦用量的10倍）。動物分籠飼養，將受試藥物混勻于飲水中，連續飲用28 d，采食不限。

2 觀察指標與測定方法

2.1 臨床表現每天觀察各組大鼠的活動、采食、飲水及發病情況。包括被毛是否貼身或稀疏豎散，是否神態萎靡、蜷縮不動、過度興奮、躁動驚跳、肌肉麻痹或震顫、步態異常。出現中毒反應的大鼠取出單籠飼養，發現死亡或瀕死大鼠及時剖檢。

2.2 體重、采食情況測定分別于給藥后的7、14、21和28 d對各組大鼠進行稱重，比較其體重變化情況；每天記錄各組的飼料添加量，于給藥后的第7、14、21、28 d 測定各組的飼料剩余量，計算各組每周大鼠的平均采食量。

2.3 血液理化指標測定于給藥28 d后，每組20只大鼠（雌雄各半）摘眼球采血，用血液細胞分析儀測定白細胞計數及分類、紅細胞計數、血紅蛋白含量測定。分離血清，用試劑盒測定AST、ALT、BUN、CRE、ALB、TP、CHOL、GLU、TG 等血液生化指標。

2.4 臟器指數測定上述于28 d后摘除眼球取血的大鼠，取血后剖檢，稱量心、肝、脾、腎、肺的重量，計算各臟器指數。稱量前用濾紙吸干表面水分。臟器指數＝臟器濕重（g）／體重（g） ×100。

2.5 主要臟器剖檢與組織學檢查將對照組和高劑量組的試驗大鼠及剖檢異常的試驗大鼠進行詳細檢查，其它劑量組的試驗大鼠同時取材保存，當高劑量組檢查有異常病變時再進行檢查。受檢的臟器為：心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、卵巢、睪丸。

2.6 數據處理用SPSS 19.0進行單因素方差分析，采用多個試驗組和一個對照組間的兩兩比較方法統計。

3 結果與分析

3.1 各組大鼠臨床表現觀察在整個試驗過程觀察并記錄高、中、低劑量試驗組和對照組大鼠的毛色潔凈度，四肢、眼和瞳孔、攝食、飲水，糞便以及皮膚有無過敏反應。結果均未見異常。

3.2 復方芩蘭口服液對大鼠體重的影響由表1結果可以看出，試驗開始時各試驗組間大鼠的體重均無顯著差異（P ＞0.05），連續用藥后的 7、14、21和28 d，復方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的體重與對照組間也均無顯著差異（P＞0.05），表明以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續給藥4周，對大鼠的體重無明顯影響。

表1 復方芩蘭口服液對各組大鼠體重的影響（SD）Tab 1 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on body weight of rats in each group（SD）

注：同一列標記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）Note：Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）.

3.3 復方芩蘭口服液對大鼠采食量的影響由表2結果可以看出，各受試藥物組和不用藥對照組大鼠的每周平均采食量基本一致，無差異。表明復方芩蘭口服液對大鼠的采食量無明顯影響。

表2 復方芩蘭口服液對各組大鼠采食量的影響Tab 2 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on feed intake of rats in each group

3.4 復方芩蘭口服液對大鼠主要臟器指數的影響由表3結果可以看出，復方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的肝指數、脾指數、腎指數、心指數和肺指數均與不用藥對照組無顯著差異（P＞0.05），受試藥物以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續給藥4周，未見對大鼠的主要臟器指數造成明顯影響。

表3 復方芩蘭口服液對大鼠主要臟器指數的影響結果（SD）Tab 3 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on the main organ index of rats （SD）

注：同一行標記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）。Note： Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）.

3.5 試驗大鼠血液常規指標結果由表4結果可以看出，復方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的紅細胞總數、白細胞總數、血紅蛋白、淋巴細胞百分率、單核細胞百分率、嗜中性粒細胞百分率、嗜酸性粒細胞百分率和嗜堿性

粒細胞百分率均與不用藥對照組無顯著差異（P ＞0.05），表明以擬推薦劑量的40 倍（80 mL／L）連續給藥4周，對大鼠的血常規無明顯影響。

表4 復方芩蘭口服液對大鼠血液常規指標的影響結果（SD）Tab 4 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood routine indexes of rats

3.6 試驗動物血液生化指標檢測結果由表5可以看出，復方芩蘭口服液高、中、低劑量組大鼠的門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、血清白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHOL）、血糖（GLU）和甘油三酯（TG）均與不用藥對照組無顯著差異（P＞0.05），表明以臨床推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續給藥4周，對大鼠的血常規無明顯不良影響。

表5 復方芩蘭口服液對大鼠血液生化指標的影響結果（SD）Tab 5 The effect of Fufang Qilan Oral Liquid on blood biochemical parameters of rats

注：AST：門冬氨酸氨基轉移酶；ALT：丙氨酸氨基轉移酶；BUN：尿素氮；CRE：肌酐；ALB：血清白蛋白；TP總蛋白、CHOL總膽固醇；GLU：血糖；TG：甘油三酯。同一行標記不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）；無不同字母代表差異不顯著（P＞0.05）。Note： AST： Aspartate aminotransferase； ALT： Alanine aminotransferase； BUN： Urea nitrogen； CRE： Creatinine； ALB： Serum albumin； TP： Total protein； CHOL： Total cholesterol； GLU： Blood glucose； TG：Triglyceride.Different lowercase letters in the same columnindicated that the difference was significant（P ＜0.05）； No different letters indicated that the difference was not significant（P ＞0.05）

3.7 試驗大鼠病理組織學檢查結果試驗結束后對各組大鼠進行捕殺剖檢，肉眼進行病理學觀察。主要觀察心、肝、脾、肺、腎等主要臟器的外形、體積、色澤是否正常，有無充血、出血、腫脹和壞死等異常現象。結果發現，各用藥組與對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器均未見任何異常。

取高劑量組和對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢、睪丸等臟器以福爾馬林固定，石臘切片，鏡檢各臟器的組織學結構變化（圖1～圖2）。結果發現，高劑量組與對照組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、卵巢及睪丸組織學結構清楚，未見明顯異常。

結果表明，受試藥物以擬推薦劑量的40倍（80 mL／L）連續給藥4周，未見對大鼠主要臟器外觀形態及組織結構造成明顯影響。

圖1 大鼠主要臟器組織病理學（40×）Fig 1 The main organs of rats histopathology（40×）

圖2 大鼠主要臟器組織病理學（40×）Fig 2 The main organs of rats histopathology（40×）

4 討論與結論

中獸醫認為傳染病為瘟病，病邪自口鼻而入，不在腑臟外，不在經絡舍，于夾脊之內。肺為嬌臟，易感風邪，易受六淫侵犯，繼而感受多種疫病而發?。?］。雞傳染性喉氣管炎是由瘟疫之毒犯肺引起的一種肺熱咳喘之癥［5-6］。復方芩藍口服液四種藥材合用，共奏清熱解毒、宣肺平喘、利咽消腫之功效，用于多種原因引起的發熱、咳嗽、咽喉腫痛的防治。根據獸藥研究技術指導原則［7］，探究了復方芩藍口服液的安全性。

長期毒性試驗即反復給藥的毒性試驗，在實驗過程中需要觀察動物在反復給藥過程中的毒性反應，了解藥物劑量與中毒程度的關系及毒性反應的安全劑量。在藥物安全評價中，由于藥物作用的影響，常會引起動物一些器官質量的減低，根據臟器系數來檢驗動物的臟器是否受到藥物的不良影響［8］。本試驗通過將復方芩蘭口服液在一定時間內連續高劑量給試驗動物反復飲喂，觀察動物出現損害的靶組織或靶器官及劑量效應關系，了解試驗動物對復方芩蘭口服液能夠耐受的劑量范圍，從而為評價復方芩蘭口服液能否安全應用于臨床提供科學依據，以保證用藥安全。

長期毒性試驗結果表明，復方芩藍口服液以20、40、80 mL／L 劑量連續用藥 28 d，在觀察期內未見大鼠有不良反應，精神狀態良好、飲食正常，各劑量組對主要臟器的臟器指數未見明顯的影響，對試驗大鼠心、肝、脾、肺、腎等主要臟器未見肉眼及組織學病理變化。

血液生理指標是判定藥物毒性的重要指標［9］，血液生化指標判定了藥物對主要臟器毒性作用［10］。長期毒性試驗結果表明，整個過程中受試藥物的三個劑量組的血液學常規、血液生化各項指標測定結果均與對照組無顯著差異（P＞0.05），受試藥物對試驗動物大鼠未顯現任何毒性反應，表明復方芩蘭口服液是安全、無毒性的中獸藥制劑，可以安全的用于臨床。