兩種中藥顆粒劑對正常小鼠免疫細胞因子調節作用的研究

葉志惠，蘭新財，歐 彬，趙麗麗，麻軍法，盧 駿

（浙江金大康動物保健品有限公司，浙江金華321016）

機體免疫系統擔負著調節各細胞間多種生理功能的任務，而發揮這些重要調節功能的蛋白質之一是細胞因子。IL-2、IFN-γ、TNF等細胞因子主要介導與細胞免疫有關的免疫應答，IL-4等細胞因子主要參與體液免疫。IL-2可促進T細胞生長、B細胞增殖分化，增強細胞毒T淋巴細胞的殺傷作用，提高NK細胞活性；IL-4在調節T淋巴細胞、B淋巴細胞的分化和活化，促進以Th2細胞為特征的免疫應答過程中發揮重要作用。

隨著養殖集約化程度的不斷提高，因免疫抑制性疾病、霉菌毒素中毒、抗生素濫用、應激等造成免疫抑制問題較為突出，補益類中藥和方劑對調節機體免疫力方面具有獨特的優勢。

芪貞增免顆粒被收載于國家標準，并已獲得發明專利授權；人參莖葉總皂苷顆粒為國家三類新獸藥。該兩種中藥顆粒劑在增強體液免疫方面已進行了大量研究工作，為了進一步考察該兩種中藥顆粒劑對正常小鼠IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF等細胞因子的作用，特進行本試驗，為下一步進行芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒的臨床研究和推廣應用提供依據。

1 材 料

1.1 試驗藥物 芪貞增免顆粒（由浙江金大康動物保健品有限公司提供，批號：20180505，試驗給藥劑量定為低劑量組 0.3 g／kg·bw，高劑量組 0.9 g／kg·bw）。

人參莖葉總皂苷顆粒（由浙江金大康動物保健品有限公司提供，批號：20180506，試驗給藥劑量定為低劑量組50 mg／kg·bw，高劑量組150 mg／kg·bw）。

以上兩種中藥顆粒劑的低劑量組為臨床推薦用量，高劑量組為臨床推薦用量的3倍。

1.2 試驗動物 ICR小鼠，SPF級，體重為18～20 g，雌雄各半。南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供。

1.3 試驗材料 小鼠血清 IL-2、IL-4、TNF-α及INF-γ細胞因子含量ELISA試劑盒：采購自南京建成生物工程有限公司，生產批號均為201806。注射器、灌胃針、燒杯、解剖器械、電子天平等。

2 方 法

2.1 飼養管理 試驗動物飼養于清潔、安靜的環境中，環境溫度控制在20℃左右，自然光照，飼喂鼠全價顆粒料（采購自南京江寧區青龍山動物繁育場，生產批號：2018060501），自由采食和飲水。試驗前適應性飼養3 d，觀察其健康狀況，選擇健康、營養狀況良好的進行試驗。

2.2 試驗分組 將芪貞增免顆粒與人參莖葉總皂苷顆粒分別配置成高、低兩個濃度，每天每只小鼠灌胃不同濃度的溶液0.1 mL／10 g。試驗小鼠隨機分為5組，分別為對照組及兩個藥物的高劑量組、低劑量組，每組10只，雌雄各半。試驗期15 d。

2.3 檢測指標及方法

2.3.1 一般狀態 分別于試驗開始、第 7 d、第15 d每天早上于固定時間點測定各組小鼠的飲食量、飲水量、體重，觀察小鼠外觀、精神狀態等變化情況。

2.3.2 胸腺指數和脾臟指數測定 小鼠末次給藥后12 h，禁食不禁水，稱量體重、眼球采血后，脫頸處死，剖取胸腺和脾臟，濾紙吸取表面殘血及多余水分，稱取濕重，計算胸腺指數和脾臟指數。

2.3.3 小鼠血清細胞因子含量檢測 小鼠眼球采血后靜置2 h，4000 rpm離心，收集血清，分裝，于-20℃保存。按照ELISA試劑盒說明，檢測小鼠血清細胞因子IL-2、IL-4、TNF-α及INF-γ含量。

3 結果與分析

3.1 臨床表現 試驗過程中，各組小鼠精神狀態良好，毛發順暢，采食飲水正常，糞便干燥無異常，未觀察到臨床可見的異常情況（見圖1）。試驗結束后，剖檢大體檢查，內臟器官均正常，無可見的大體病變（見圖2）。

3.2 小鼠體重變化 從表1可知，整個試驗過程中兩種中藥顆粒劑的高劑量組和低劑量組小鼠的不同時間的體重均與對照組差異不顯著（P＞0.05）。表明兩種中藥顆粒劑對小鼠的生長基本無影響。

圖1 試驗小鼠外觀正常Fig 1 The appearance of the test mice was normal

圖2 解剖無可見病變Fig 2 No visible lesion in anatomy

表1 對小鼠體重的影響（單位：g）Tab 1 Effects on body weight of mice

3.3 對小鼠免疫器官指數的影響

由表2可見，兩種中藥顆粒劑高、低劑量組對雌性小鼠的脾臟和胸腺的器官指數均影響較小，未見顯著差異，但各給藥組對雄性小鼠的胸腺均有較顯著的促進作用（P＜0.05），但對脾臟的影響較小，人參莖葉總皂苷高劑量組的脾臟指數顯著小于對照組（P ＜0.01）。

表2 對小鼠免疫器官指數的影響Tab 2 Effect on immune organ index in mice

3.4 對血清細胞因子含量的影響

由表3可見，兩種中藥顆粒劑的低劑量組均能夠顯著的促進雌性小鼠的血清IL-2、IL-4和TNF-α的分泌（P＜0.01），其中芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組同時對雌性小鼠的血清IFN-γ有極顯著的促進作用（P＜0.01）；人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組對雄性小鼠的血清IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α具有顯著的促進作用（P＜0.05），但高劑量組則差異不顯著，同時芪貞增免顆粒的低劑量組對雄性小鼠的IL-4和IFN-γ也有顯著的促進作用，但其他指標影響不大。從總體試驗結果看，兩種中藥顆粒劑的低劑量組對小鼠血清幾種細胞因子的促進作用要優于高劑量組。

表3 對細胞因子IL-2、IL-4的影響Tab 3 Effect on cytokines IL-2 and IL-4

表4 對細胞因子IFN-γ、TNF-α的影響Tab 4 Effect on cytokines IFN-γ and TNF-α

4 討論與結論

4.1 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對小鼠血清中IL-2的影響 IL-2是由T淋巴細胞在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下產生的，在機體免疫反應中具有重要調節作用的一種淋巴因子，IL-2具有廣泛的生物學特性：促進T淋巴細胞的克隆擴增，通過T淋巴細胞數目增多及CD4＋T細胞活性的增強提高機體的免疫功能［1］；促進胸腺細胞的分裂，并由IL-2與T或B淋巴細胞表面特異受體相互作用，誘導合成DNA；使靜止的前細胞毒T細胞轉化為細胞毒性T細胞，以發揮其細胞毒作用［2］；提高自然殺傷細胞的活性；協同刺激B細胞增殖和分泌Ig［3］；調控免疫干擾素的釋放，誘導淋巴細胞產生干擾素等，從而進一步增強了機體的免疫功能。

試驗中，兩種中藥顆粒劑的不同劑量均能夠顯著的促進雌性小鼠血清IL-2的分泌，并且人參莖葉總皂苷的低劑量對雄性小鼠也有極顯著的促進作用，芪貞增免顆粒兩個劑量雖能一定程度上提高，但是差異不顯著（P ＞0.05）。

4.2 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對小鼠血清IL-4的影響 有學者認為，Th1／Th2通過自身或其它免疫細胞分泌的細胞因子進行自我調節和相互調節，維持 Thl／Th2細胞之間的免疫平衡［4］。 Thl／Th2的平衡狀態作為機體免疫平衡的核心，在機體的內環境特別是免疫系統穩定方面起著重要調節作用。Abehsira-Amor等［5］證實 IL-4對Th0細胞分化為Th1和Th2起著關鍵性調控作用。IL-4是II型輔助T細胞（Th2細胞）分泌的細胞因子。IL-4的生物作用，包括刺激活化B細胞和T細胞增殖、CD4＋T細胞分化成II型輔助T細胞。它也在調節體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用。

試驗中，兩種中藥顆粒劑的不同劑量均能夠極顯著的提高血清中IL-4的含量，同時低劑量組對雄性小鼠的IL-4也有顯著的提升作用，但是高劑量組卻沒有達到顯著水平。

4.3 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對小鼠血清IFN-γ的影響 干擾素是細胞受到適度的刺激后產生的一種微量的、具有廣泛生物學活性的糖蛋白，一般可分為IFN-α、IFN-β和IFN-γ。其中IFN-γ的抗腫瘤及免疫調節作用均比IFN-α和IFN-β強。現代研究表明，許多中藥能誘導機體產生IFN-γ，且中藥具有來源廣泛、價格低廉及毒副作用小等優點。

試驗中，兩種中藥顆粒劑的低劑量組均可極顯著提高小鼠血清中IFN-γ含量，但是兩種中藥顆粒劑的高劑量組與對照組相比雖有升高但是差異不顯著。兩種中藥顆粒劑中活性成分本身就是免疫活性物質，所含的多糖與皂甙，能夠促進機體網狀內皮系統，增強巨噬細胞吞噬功能，提高免疫細胞活性，誘導干擾素等細胞因子的產生，從而提高機體免疫力。

4.4 芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒對小鼠血清TNF-α的影響 TNF按結構可分為TNF-α和TNF-β，目前對TNF-β功能所知有限，研究較多的是TNF-α。TNF-α來源廣泛，體內的多種細胞，如單核／巨噬細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、內皮細胞、表皮細胞、角質細胞、成骨細胞和星形細胞等均具有產生和釋放TNF-α的能力，是機體維持內部自穩、抵抗各種致病因素不可或缺的免疫調節因子［6］。TNF-α具有廣泛的生物學功能：強大的抗腫瘤作用，可直接殺傷腫瘤細胞及抑制DNA的合成；可活化巨噬細胞，增加NK細胞活性，誘生如 IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、CSF 等多種免疫調節介質，還能調節T、B淋巴細胞的增殖和分化，在宿主防御機制中起重要作用［7］。

試驗中，兩種中藥顆粒劑對雌性小鼠的血清TNF-α的含量具有極顯著的促進作用，人參莖葉總皂苷顆粒的低劑量組對雄性小鼠亦有極顯著的促進作用，芪貞增免顆粒對雄性小鼠的TNF-α雖有提升但是差異不顯著。

通過試驗研究，芪貞增免顆粒和人參莖葉總皂苷顆粒在一定劑量范圍內能夠顯著提高小鼠血清IL-2、IL-4、IFN-γ 和 TNF-α 的分泌，對雌性小鼠的作用尤為顯著。表明該兩種中藥顆粒劑具有顯著提高小鼠相關免疫細胞因子的作用。對下一步該兩種中藥顆粒劑的臨床研究和推廣應用具有重要意義。