高效液相色譜法同時測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的含量

趙有軒，張傳津，張志民，章安源

（山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，濟南250022）

博落回注射液主要含有血根堿和白屈菜紅堿等生物堿，具有抗菌消炎、潤腸止瀉的功能，主要用于仔豬黃白痢的防治［1-3］。博落回注射液現(xiàn)收載于《獸藥質(zhì)量標準》（2017 年版［4］）中藥卷中，質(zhì)量控制主要是采用薄層色譜法對其中的血根堿和白屈菜紅堿進行鑒別，結(jié)合紫外-可見分光光度法測定吸光度值作限度檢查，未對這兩種有效成分進行含量測定。該制劑為罌粟科博落回（Macleaya cordata（Willd.）R.Br.）的果實經(jīng)提取分離制成的生物堿硫酸鹽水溶液。因博落回果原料稀缺，制劑工藝相對復雜，導致該產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。為有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量，本文經(jīng)過探索嘗試，建立了高效液相色譜法同時測定博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿含量的方法［4-11］。結(jié)果顯示：本方法具有操作簡單、分離迅速、靈敏度高等特點，可以用于博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的測定。

1 材料與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配PDA檢測器（安捷倫，美國）；U-3900紫外分光光度計（日立，日本）；BP211D分析天平 （賽多利斯，德國）；PB-10酸度計（賽多利斯，德國）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（密理博，美國）。

1.2 藥品與試劑 鹽酸血根堿，批號：510001-201101，含量：99.3%，來源：中國食品藥品檢定研究院；白屈菜紅堿，批號：111718-200501，含量：100%，來源：中國藥品生物制品檢定所。甲醇，乙腈均為色譜純；三乙胺、磷酸和鹽酸均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL／min；流動相：乙腈-0.2%三乙胺溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），二極管陣列檢測器，檢測波長：270 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液制備 稱取鹽酸血根堿100 mg，置于10 mL容量 瓶中，稱取白屈菜紅堿100 mg，置于另一10 mL容量瓶中，分別加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）溶解，稀釋至刻度，即分別得血根堿和白屈菜紅堿對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液制備 博落回注射液三批，分別為：批號-2018122411，來源：山東華爾康獸藥有限公司；批號-20180901，來源：山東圣旺藥業(yè)股份有限公司；批號-20180201，來源：山西省芮城科龍獸藥有限公司。分別精密量取博落回注射液5 mL，加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）稀釋至100 mL，搖勻，即得。

2.3 專屬性試驗色譜圖 在上述色譜條件下，確定陰性對照色譜圖，血根堿和白屈菜紅堿的色譜圖以及博落回注射液色譜圖，如下圖1，圖2，圖3所示。

2.4 線性關(guān)系考察 吸取上述對照品溶液逐級稀釋，分別制成 0.5、1、5、10、100 μg／mL 的血根堿溶液和 0.25、0.5、2.5、5、50 μg／mL 的白屈菜紅堿溶液，分別取10 μL進樣，以峰面積Y為縱坐標，血根堿、白屈菜紅堿濃度X（μg／mL）為橫坐標建立標準曲線。血根堿的回歸方程為Y＝33.932X-2.512，R2＝1.000；白屈菜紅堿的回歸方程為 Y ＝69.419X-7.380，R2＝1.000，相關(guān)系數(shù)良好。 （見圖 4、圖5）

2.5 添加回收試驗 精密量取博落回注射液1 mL，置20 mL容量瓶中，分別加2 mL血根堿對照品貯備液和1 mL白屈菜紅堿對照品貯備液，加甲醇-1.0%鹽酸溶液（50 ∶50）稀釋至刻度，取10 μL上機檢測，血根堿的回收率在95% ～100%之間，見表1；白屈菜紅堿的回收率在97% ～99%之間，見表2，均滿足準確度的要求。

圖1 陰性對照色譜圖Fig 1 Chromatogram of negative control

圖2 對照品中血根堿和白屈菜紅堿色譜圖Fig 2 Chromatogram of sanguinarine and chelerythrine in reference solution

圖3 博落回注射液中的血根堿和白屈菜紅堿色譜圖Fig 3 Chromatogram of sanguinarine and chelerythrine in Macleaya Cordata injection

圖4 血根堿線性曲線Fig 4 Standard curve of sanguinarine

圖5 白屈菜紅堿線性曲線Fig 5 Standard curve of chelerythrine

表1 血根堿添加回收結(jié)果Tab 1 Results of recovery for sanguinarine

表2 白屈菜紅堿添加回收結(jié)果Tab 2 Results of recovery for chelerythrine

2.6 精密度試驗 取2.2.1項下對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣，連續(xù)進6針，計算血根堿和白屈菜紅堿峰面積的 RSD，其中血根堿為0.56%，白屈菜紅堿為0.22，精密度良好。 如表3，表4所示。

表3 博落回注射液中血根堿精密度試驗（n＝6）Tab 3 Precision test of sanguinarine in Macleaya Cordata injection （n＝6）

表4 博落回注射液中血白屈菜紅堿精密度試驗（n＝6）Tab 4 Precision test of chelerythrine Macleaya Cordata injection （n＝6）

2.7 穩(wěn)定性試驗 取2.2.1項下對照品溶液，按照2.1 項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 下進樣，測定不同時間下的峰面積，RSD（n＝5），其中血根堿0.52%，白屈菜紅堿0.23%，表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 樣品測定 取2.2.2項下的3批博落回注射液，按照2.1項下的色譜條件進樣，測定峰面積，計算血根堿和白屈菜紅堿的含量，三批的血根堿含量分別是 97.65、100.32、100.96 μg／mL，白屈菜紅堿含量分別是 50.99、49.03、48.53 μg／mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 流動相的選擇 按照《獸藥質(zhì)量標準》（2003年版［3］）上博落回提取物的液相標準選擇梯度洗脫，流動相 A：乙腈，流動相 B：0.2%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），發(fā)現(xiàn)在白屈菜紅堿位置處基線漂移嚴重，影響了白屈菜紅堿的峰形，根據(jù)參考文獻［6］，改成等度洗脫，流動相乙腈 -0.2%三乙胺（磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5），洗脫效果良好。

3.2 pH的選擇 根據(jù)《獸藥質(zhì)量標準》（2003年版［3］）和參考文獻［6］，選擇 pH2.0，2.5，3.0 幾個值進行篩選，發(fā)現(xiàn)pH在2.0時，血根堿峰有拖尾，pH在3.0時，基線不平穩(wěn)，而pH在2.5時，分離效果好，峰形最好，基線平穩(wěn)，可達到最佳分離效果。

3.3 波長選擇 分別取血根堿和白屈菜紅堿對照品溶液，經(jīng)紫外-可見分光光度計法測定吸收波長，顯示血根堿在270和330 nm處有最大吸收，白屈菜紅堿在270和320 nm處有最大吸收，在270 nm下同時測定血根堿和白屈菜紅堿，結(jié)果顯示在270 nm下有較高吸收值，且分離度良好。所以選擇270 nm作為檢測波長。

《獸藥質(zhì)量標準》（2017年版［4］）上只有鑒別的方法，能定性，但是無法定量。根據(jù)本方法建立的液相方法可以快速測定血根堿和白屈菜紅堿，省去了薄層鑒別的繁瑣處理過程，達到快速測定含量的目的。相對于參考文獻［6，8］，優(yōu)化了液相色譜條件，為了增加對照品的溶解性，改變了稀釋劑，經(jīng)過一系列優(yōu)化和探索，回收率和精密度均有明顯變好，峰形較之前有明顯改善。

綜上所述，本方法具有操作簡單、分離迅速、靈敏度高等特點，可用于博落回注射液中血根堿和白屈菜紅堿的測定。