HPLC同時測定翻黃合劑中芍藥苷和鹽酸小檗堿含量

陸鳳琪，周海嬪，陳文成，甘斌艷，王亞芳

（1.安徽牧春堂天然藥物研究開發有限公司，安徽滁州239000；2.滁州學院，安徽滁州239000；3.北京市獸藥監察所，北京102629）

現代中獸醫從辨證論治角度分析雞大腸桿菌病屬疫毒內侵、肺胃熱盛、血瘀氣滯，應以清熱解毒、活血行氣為主［1］。翻黃合劑是由翻白草、千里光、大黃、黃連、赤芍等藥材組成，臨床用于雞大腸桿菌病，具有清熱解毒、活血化瘀、燥濕止痢的功效。其質量標準研究只針對鹽酸小檗堿進行含量測定，未對赤芍中主要成分芍藥苷進行檢測，故本文參照有關文獻［2-5］，采用高效液相色譜法同時測定翻黃合劑中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量，為翻黃合劑的質量控制提供科學的依據。

1 材 料

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀；EX125DZH型電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；UPT-C-5型超純水機（邦西科技（上海）有限公司）；RE-2000B型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

翻黃合劑為安徽牧春堂天然藥物研究開發有限公司制備（批號：20190319）。芍藥苷對照品（批號：110736-201741），鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201613），以上均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，磷酸為優級純，中性氧化鋁（200-300目），鹽酸、甲醇為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成芍藥苷濃度為99.76 μg／mL、鹽酸小檗堿濃度為 23.85 μg／mL 的混合對照品溶液，搖勻，濾過，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取翻黃合劑10 mL，置具塞錐形瓶中，加鹽酸0.1 mL，85 ℃水浴30 min，超聲處理（功率 150 W，頻率 40 KHz）20 min，加于中性氧化鋁柱（200 ～300 目，5 g，內徑為1 cm）上，用甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇50 mL使溶解，轉移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 未過柱純化供試品溶液的制備 精密量取翻黃合劑10 mL，置50 mL量瓶中，加鹽酸0.1 mL，85℃水浴30 min，加甲醇30 mL，超聲處理（功率150 W，頻率40 KHz）20 min，放冷，加甲醇定容至刻度，濾過，精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，轉移置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 按處方組成與制劑工藝，制備缺赤芍和黃連的陰性樣品，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件 YMC-Pack Pro C18（250 mm ×4.6 mm）；流動相A為乙腈，B為0.15%磷酸溶液，梯度洗脫程序見表1；流速為1.0 mL／min；柱溫為26℃；檢測波長為245 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient eluted program

2.3 供試品溶液制備工藝與系統適用性試驗 按上述色譜條件，分別取對照品溶液、供試品溶液、未過柱純化供試品溶液和陰性對照溶液各10 μL進樣，記錄色譜圖。理論板數按芍藥苷和鹽酸小檗堿峰計算不低于4000，芍藥苷保留時間為13.828 min，鹽酸小檗堿保留時間為28.623 min，峰型對稱，無雜質干擾且基線平穩，陰性無干擾。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察 分別取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的芍藥苷和鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成芍藥苷濃度為491.96 μg／mL、鹽酸小檗堿濃度為 102.50 μg／mL 的母液。加甲醇將母液進行倍比稀釋，分別稀釋成芍藥苷濃度為 491.96、245.98、122.99、61.49、30.75 μg／mL和鹽酸小檗堿濃度為 102.50、51.25、25.63、12.81、6.41 μg／mL 的對照品溶液。 各進樣 2 次，進樣體積10 μL，按上述色譜條件測定。以芍藥苷和鹽酸小檗堿峰面積為縱坐標（Y），以對照品進樣量為橫坐標（X），繪制標準曲線。見表2。

表2 線性關系Tab 2 Linear relationship

2.5 精密度試驗 精密吸取芍藥苷和鹽酸小檗堿混合對照品溶液10 μL，重復進樣6次，按上述色譜條件測定，結果芍藥苷和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.14%和0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件測定，分別于0、2、4、6、8 h 后進樣，進樣量為10 μL，測定峰面積。結果芍藥苷和鹽酸小檗堿峰面積的 RSD 分別為1.32%和0.57%（n＝5），表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.7 重復性實驗 取同一批的翻黃合劑（批號為20190319），按2.1.2 所述方法平行制備 6 份供試品溶液，進樣測定含量。結果芍藥苷和鹽酸小檗堿含量的 RSD 分別為0.90%和0.64%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的翻黃合劑6份，精密吸取10 mL，分別加入芍藥苷6.20 mg和鹽酸小檗堿 1.90 mg，加熱至完全溶解，按2.1.2 所述方法制備供試品溶液，進樣測定含量，計算回收率。見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3 Results cosfficient of recovery test（n ＝6）

2.9 樣品含量測定 取三批樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算樣品中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量。見表4。

表4 3批樣品中含量測定結果Tab 4 Content determination results of three batch sample

3 討論與結論

翻黃合劑是由翻白草、千里光、大黃、黃連、赤芍等藥材提取精制制成的中藥合劑，具有抗菌、抗炎、活血、祛瘀等功效。為了保證藥物臨床有效性，采用HPLC同時控制翻黃合劑中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量。翻黃合劑為復方制劑，含有多種化合物，在制備供試品溶液時，直接采用甲醇做溶劑對樣品進行稀釋，得到的供試品溶液雜質成分多，目標峰基線偏高，雜質峰有干擾，無法測定樣品中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量。采用中性氧化鋁柱對供試品溶液進行處理，可以除去部分雜質，使目標峰分離度好，無雜質峰干擾。

為了同時測定翻黃合劑中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量，對多種流動相進行了選擇，選擇甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水的不同比例，所得目標峰峰型、分離度均不理想，最后選擇乙腈-0.15%磷酸溶液作為流動相進行梯度洗脫，經不斷調整梯度洗脫比例，所得目標峰出峰時間、峰型、分離度均較好。

綜上所述，該方法簡單、可靠，可以同時檢測翻黃合劑中芍藥苷和鹽酸小檗堿的含量，為翻黃合劑的質量控制提供了依據。