2017-2018年吉林部分地區規模化豬場豬細環病毒的遺傳變異分析

劉東旭，李國江，苗麗娟，沙萬里，尹柏雙?

（1.吉林農業科技學院，吉林吉林132101；2.預防獸醫學吉林省重點實驗室，吉林吉林132101）

豬細環病毒（Torque teno sus virus，TTSuV）是一種無囊膜、環狀、單股負鏈DNA病毒，病毒粒子直徑約 30 ～32 nm［1］。 人細環病毒（Torque teno virus，TTV）是由日本學者Nishizawa等在1997年使用代表性差異分析技術發現的一種新病毒。1999年，美國學者首次從豬血清中分離到該病毒后，已在中國、加拿大、日本等國家發現TTSuVs的流行［2］。 根據核苷酸序列差異，TTSuVs可分為TTSuVl和 TTSuV2兩種基因型。其中 TTSuVl有4 種亞型，即 TTSuVla、TTSuVlb、TTSuVlc和 TSuVld。TTSuV2 有 四 種 亞 型，即 TTSuV2a、TTSuV2b、TTSuV2c和TTSuV2d［3］。該病毒編碼區中包含3個開放閱讀框（ORF1-ORF3），1個 TATA盒和1個PolyA。其中ORF1基因是編碼衣殼蛋白和復制相關結構域的基因，不同毒株之間差異較大，可用于TTSuVs的分型鑒定。

吉林省雖是養豬大省，但到目前為止仍沒有關于豬群TTSuVs遺傳變異分析的報道。為此，本研究對2017-2018年吉林省豬生態養殖及疫病防控科技創新中心收集的574份血清樣品進行檢測，并對其部分毒株進行ORF1序列分析，了解吉林部分地區規模化豬場TTSuVs的基因特性，為進一步研究TTSuVs的遺傳進化提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料的收集 收集2017-2018年來自吉林地區10家規模化豬場的血清樣品574份。豬場所在地分別為：長春市、吉林市、白城市、四平市、通話市、白山市、延吉市7個地區。同時記錄每份樣品的基本信息，包括豬的身體狀況、年齡及品種等。

1.2 材料與試劑 UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒購自上海生物工程技術服務有限公司；PCR克隆載體pMD18-T、感受態細胞JM109、蛋白酶K、DNA分子量標準DL2000、Taq酶、dNTP購自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、瓊脂粉購自維特杰公司。

1.3 引物的設計與合成 在對比分析GenBank上公布的國內外不同TTSuVs毒株ORF1基因序列的基礎上，選取保守區，并在引物設計軟件primer 6.0的輔助下設計引物。各PCR反應體系的引物序列如表1所示。

表1 分段擴增所用的引物序列Tab 1 Primer sequences for segmented amplification

1.4 病毒DNA的提取及TTSuVs陽性率的檢測應用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，按照說明書，提取574份檢測樣品中的病毒DNA并進行PCR鑒定，分析吉林部分地區規模化養豬場TTSuVs的陽性率。

1.5 TTSuVs ORF1全基因擴增及測序 為研究TTSuVs在同一感染體內不同亞型間的基因特點，本研究根據所收集樣品的地點，對每家規模化豬場選取同時感染TTSuV1和TTSuV2的樣品1份，應用所設計的引物，擴增各代表株的ORF1全基因序列。將擴增產物純化并與pMD18-T載體連接后，42℃熱擊轉化到JM109感受態細胞中，進行藍白斑篩選。篩選后挑取白色菌落，經鑒定后進行測序。

1.6 TTSuVs ORF1基因的序列分析 采用DNAMAN、DNAStar、MEUA等生物信息學軟件對TTSuVs測序株ORF1基因進行分析，使用參考株資料見表2。

2 結果與分析

2.1 吉林部分地區規模化豬場TTSuVs流行情況調查 對從10家規模化豬場收集到的574份血清樣品進行PCR鑒定，其中共檢出201份TTSuV1陽性樣品，其感染率為36.75%；363份TTSuV2陽性樣品，感染率為63.2%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染樣品有174份，混合感染率為30.3%。在吉林部分地區規模化豬場中，TTSuV1感染率最高的城市是長春市，感染率為48.97%；TTSuV2感染率最高的城市是延吉市，感染率為76.28%；而混合感染率最高的城市同樣也是長春市，感染率為42.82%。結果表明，吉林省部分地區規模化豬場中，TTSuV2的感染率普遍高于TTSuV1，且各個年齡段的豬均可感染TTSuVs（表3-表5）。

2.2 TTSuVs ORF1基因的擴增 根據所收集樣品的地點，每家規模化豬場選取同時感染TTSuV1和TTSuV2的樣品1份，并進行TTSuV1、TTSuV2 ORF1全基因序列擴增，擴增結果見圖1和圖2。將PCR結果測序后，通過軟件拼接為完整的ORF1全基因序列，大小為2000 bp左右，與預期結果相符，完成了TTSuVs ORF1基因的擴增與測序。

表2 本研究使用參考株資料表Tab 2 The reference strain list

表3 2017-2018年吉林部分地區TTSuVs感染情況Tab 3 The infection type of TTSuVs in the part of Jilin during 2017-2018

表4 吉林部分地區2017-2018年TTSuVs分布情況Tab 4 Distribution of TTSuVs in parts of Jilin during 2017-2018

表5 吉林地區2017-2018年TTSuVs不同年齡段分布情況Tab 5 The pig of different age groups of TTSuV in Jilin during 2017-2018

圖1 TTSuV1 ORF1全基因分段擴增結果Fig 1 Results of TTSuV1 ORF1 gene amplification

圖2 TTSuV2 ORF1全基因分段擴增結果Fig 2 Results of TTSuV2 ORF1 gene amplification

2.3 TTSuVs ORF1基因核苷酸同源性分析 將所測得的TTSuVs ORF1全基因序列與國內外參考株的ORF1序列進行對比分析，結果見圖3、圖4。結果顯示，10株TTSuV1測序株之間的核苷酸同源性為75.7% ～94.7%，其與 2004年巴西參考株AY823990之間同源性最高，為98.0%；與2018年巴西參考株MH170071的同源性最低，為61.2%。10株TTSuV2測序株之間的核苷酸同源性為77.5% ～94.0%，其與 2010年西班牙參考株GU570205及2010年中國參考株JF694118之間同源性最高，為 97.1%；與 2015年日本參考株KR054750同源性最低，為77.5%。

圖3 10株TTSuV1測序株與國內外參考株ORF1核苷酸序列的同源性對比結果Fig 3 Comparison of homology between 10 sequencing strains of TTSuV1 and ORF1 sequences from domestic and foreign strains

圖4 10株TTSuV2測序株與國內外參考株ORF1核苷酸序列的同源性對比結果Fig 4 Comparison of homology between 10 sequencing strains of TTSuV2 and ORF1 sequences from domestic and foreign strains

2.4 TTSuVs ORF1基因編碼的蛋白氨基酸同源性分析 將測序結果推導出的氨基酸序列與國內外參考株的ORF1氨基酸序列進行對比分析，結果見圖5、圖6。結果顯示，10株TTSuV1測序株之間的氨基酸同源性為48.1% ～88.2%，其與2010年中國參考株HM633253之間同源性最高，為96.2%；與2010年西班牙參考株GU570198、GU570200同源性最低，為34.2%。10株TTSuV2測序株之間的氨基酸同源性為70.6% ～87.4%，其與2010年西班牙參考株 GU570205之間同源性最高，為93.6%；與2015年日本參考株KR054750同源性最低，為 72.4%。

2.5 TTSuVs ORF1基因編碼的蛋白氨基酸序列突變位點分析 TTSuVs測序株ORF1基因推導的氨基酸序列與國內外參考株的ORF1氨基酸序對比存在多處氨基酸的差異，結果見圖7、圖8。結果顯示，在296～464aa處是TTSuV1 ORF1的超變區，10株TTSuV1測序株在392aa和397aa均有與1b型相同的5個氨基酸的缺失；TTSuV1-JL在10aa處有一個氨基酸的突變（R變K），與其他毒株均不相同。與2017年中國參考株 KY937993相比，TTSuV1-JL、TTSuV1-CC1和 TTSuV1-CC2在64～65aa處有兩個氨基酸的缺失；TTSuV1-TH1在620～622aa處有三個氨基酸的缺失。200～280aa是TTSuV2 ORF1的超變區，10株TTSuV2測序株在39aa和47aa處均有兩個氨基酸的缺失，與2012年的中國參考株 JQ782385相同；TTSuV2-BC和TTSuV2-YB在292～294aa處存在與2010年中國參考株HM633220相同的三個氨基酸的缺失；TTSuV2-JL、TTSuV2-BC、TTSuV2-YB 和TTSuV2-SP2在377aa處有與2012年中國參考株JQ782385相同的一個氨基酸的缺失。

圖5 10株TTSuV1測序株與國內外參考株ORF1氨基酸序列的同源性對比結果Fig 5 Comparison of amino acid sequences between 10 sequencing strains of TTSuV1 and ORF1 sequences from domestic and foreign strains

圖6 10株TTSuV2測序株與國內外參考株ORF1氨基酸序列的同源性對比結果Fig 6 Comparison of amino acid sequences between 10 sequencing strains of TTSuV2 and ORF1 equences from domestic and foreign strains

圖7 部分TTSuV1 ORF1基因編碼氨基酸序列對比結果Fig 7 Comparison of TTSuV1 ORF1 gene coding amino acid sequences

圖8 部分TTSuV2 ORF1基因編碼氨基酸序列對比結果Fig 8 Comparison of TTSuV2 ORF1 gene coding amino acid sequences

2.6 TTSuVs ORF1基因遺傳進化樹分析 為進一步分析吉林部分地區TTSuVs毒株與其他參考株在進化上的關系，將20株測序株與國內外發表的參考株共同構建遺傳進化樹，結果見圖9、圖10。結果顯示，在吉林部分地區規模化豬場中，測序的10株TTSuV1均屬于 TTSuV1-lb型，其中測序株TTSuV1-JL、TTSuV1-CC1和 TTSuV1-CC2與巴西參考株親緣關系較近；測序株 TTSuV1-BC、TTSuV1-YB、TTSuV1-SP1和 TTSuV1-SP2與2010年中國參考株HM633253親緣關系較近。10株 TTSuV2測序株中，TTSuV2-JL、TTSuV2-SP2、TTSuV2-YB和TTSuV2-BC屬于TTSuV2-2a型；TTSuV2-CC1、TTSuV2-CC2、TTSuV2-TH2 和TTSuV2-SP1屬于 TTSuV2-2c型；TTSuV2-BS與TTSuV2-TH1屬于TTSuV2-2b型。測序結果表明，在吉林部分地區規模化豬場中流行的TTSuV1均屬于TTSuV1-lb型，而TTSuV2流行情況較為復雜，各種亞型均有涉及。

3 討論與結論

TTSuVs的感染不會立刻引發疾病，然而TTSuVs卻可以影響一些疾病的發展，甚至影響它們的結果。目前，人類的TTV已證實與自身免疫風濕性疾病、肝臟病變和呼吸性疾病有關［4］，這也使得近年來對TTSuVs的研究成為熱點。

本研究對2017-2018年間吉林部分地區規模化豬場的574份樣品進行檢測，結果顯示，TTSuV1感染率為 36.75%；TTSuV2感染率為 63.2%；TTSuV1與TTSuV2的混合感染率為30.3%，與王礞礞2009年的調查結果相近，但與徐茜2013年對江西省豬TTSuVs感染率的調查結果相反（TTSuV1的感染率為72.9%，TTSuV2的感染率為69.8%，總混合感染率為53.0%），說明TTSuVs已在我國多省份流行，但流行情況各個地域間差異較大［5］。

細環病毒的基因組具有高度變異性和多樣性，其中約2000 bp的ORF1全基因序列分型法是公認的經典分型方法之一［6］。ORF1全序列分型法是根據其核苷酸的差異來確定不同基因型，即差異程度在30%～40%之間的為不同基因型，大于40%為不同基因群［7］。ORF1全基因序列占TTSuVs基因總長度的60%，所以ORF1全基因序列分型法可以代表TTSuVs基因組多變性特點，并且該方法相對來說更加經濟有效［8-9］。對20株TTSuVs測序株ORF1基因同源性分析發現，在吉林部分地區規模化豬場中流行的TTSuV1均屬于TTSuV1-lb型，而TTSuV2流行情況較為復雜，各種亞型均有涉及。

圖9 TTSuV1測序株與參考株ORF1基因進化樹分析Fig 9 Phylogenetic tree analysis of ORF1 gene of TTSuV1 sequencing and reference strains

圖10 TTSuV2測序株與參考株ORF1基因進化樹分析Fig 10 Phylogenetic tree analysis of ORF1 gene of TTSuV2 sequencing and reference strains

現階段，國內外對于TTSuVs的研究大部分停留在流行情況調查及檢測方法的建立，而對于病毒的基因與其致病性及如何逃避宿主免疫的機制研究較少［10］。學者對于人TTV基因組研究發現其普遍存在G和A之間的轉換［11］，而在本次的調查中G和A也出現了較高的突變率，這可能與7 APOBEC3（Apolipoprotein B editing component 3）蛋白有關，但具體相關性仍需進一步的探查。

本研究對多株TTSuVs基因研究發現，其核苷酸同源性大于60%，而氨基酸同源性不及60%。對于一般的病毒，氨基酸同源性會大于其核苷酸同源性，但TTSuVs卻是核苷酸同源性大于氨基酸同源性，這和其他病毒顯著不同［12］。ORF1可能是TTSuVs編碼的最大蛋白，可能在宿主體內誘發宿主抗體的形成，推斷ORF1的多樣性可以讓其逃避宿主的免疫攻擊。

通過序列比較分析，本研究發現了一些保守區域：TTGGCCGCCGCCG，ACGAGTGCCGAAAGCTCT，ATGGATCGTCTGA，這與2011年國內學者發現的保守區并不完全相同［13］，但是均屬于高CG區，與人源TTV保守區相似［14］。對其研究顯示，突變的原因可能是在幾個不同的個體內進行序列的改變和進化，推測TTSuVs與近來發現單股DNA病毒相似，其高頻率的突變可能和病毒基因組的單鏈或和參與復制的蛋白的編碼能力有關。

近幾年來國內學者對于TTSuVs的基因研究顯示，TTSuV2 ORF1核苷酸序列較為保守，其測序的TTSuV2 ORF1核苷酸序列可與2010年中國參考株HM633231的同源性高達97%［15］。雖然在本研究中TTSuV1測序株與2010年中國參考株HM633253之間同源性最高可達96.2%，與2017年中國參考株KY937993之間同源性最高也達94.2%，但其突變頻率也最為頻繁，其序列之間的多樣性大于30%，而 TTSuV2序列之間的多樣性大于15%。TTSuV1和人源TTV在這點上具有相似性［16］，人源TTV基因組序列之間的多樣性在30%以上，這一高百分比對于DNA病毒來說是極不常見的。

有學者推測，只有一小部分人源TTV擁有可以成功感染宿主的所有組分，與HIV病毒一樣，需要不同的TTV共感染才可滿足持續性感染發生的條件［17］，即感染人類的 TTV不是一個基因型而是TTV的一個族群。為此，本研究選取同一感染體來源的TTSuVs進行分析，結果顯示，同一感染體中的兩種TTSuVs亞型在氨基酸及核苷酸分析上與其他單獨感染豬的TTSuVs亞型沒有明顯的共同差異或突變，TTSuVs不同亞型的共感染是否可以引起持續性感染以及其感染機制是什么，將是下一步的主要研究方向。

總之，本次流行病學調查更好地了解了TTSuVs在吉林部分地區規模化豬場中的流行情況，掌握了TTSuVs發生、發展的動態規律，這將有助于揭示TTSuVs遺傳變異規律，豐富其分子生物學特性內容，并為今后預防和控制TTSuVs提供理論依據，也為TTSuVs的機理研究奠定基礎。