豬源大腸桿菌floR、CTX-M、mcr-1耐藥基因多重PCR檢測方法的建立

李 孟，李金磊，申水瑩，楊鵬霞，彭 麗，李慧素，吳志明?

（1.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州450002；2.河南省獸藥飼料監察所，鄭州450008）

豬大腸桿菌病在我國許多地區的豬場都有發生，是嚴重危害仔豬安全的重要傳染病之一［1］。近些年來，豬源大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥性問題日益嚴重，有報道指出氟苯尼考的耐藥率有增加的趨勢［2］；其耐藥機制的研究主要集中在 floR基因上［3］，而且floR基因在革蘭氏陰性菌之間廣泛傳播。產超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）是細菌對β內酰胺類抗生素產生耐藥的主要機制［4］，近年來，CTX-M型ESBLs已經取代傳統的TEM型和SHV型成為全球流行最廣的ESBLs［5］。我國學者劉藝云等［6］首次報道了大腸桿菌對粘桿菌素的耐藥基因mcr-1，引起了國內外研究人員的高度關注，報道稱mcr-1基因已經在我國畜禽源大腸桿菌中廣泛存在，并且有沿食物鏈傳遞，從而危害食品安全和人類健康的風險。

氟苯尼考、頭孢噻呋、粘桿菌素作為養豬場臨床常用的抗菌藥物，其耐藥性問題不容忽視。目前，國內外報道的大腸桿菌耐藥基因檢測方法主要以大腸桿菌對同一類藥物的不同耐藥基因的多重PCR為主，尚無針對大腸桿菌對不同藥物的耐藥基因建立的多重PCR檢測方法。

本研究結合臨床常用抗菌藥的使用情況，建立大腸桿菌floR、CTX-M、mcr-1耐藥基因多重PCR的檢測方法，能為大腸桿菌耐藥基因的快速檢測提供新的檢測技術，為耐藥基因的分子流行病學調查提供技術手段，為豬源大腸桿菌耐藥性的風險評估和臨床用藥提供科學依據，從而為保障食品安全、公共衛生安全和生態環境安全提供技術支撐。

1 材 料

1.1 菌株 FloR、CTX-M、mcr-1 基因陽性菌株（已測序鑒定），大腸桿菌標準菌株ATCC25922，鼠傷寒沙門氏菌標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株、志賀氏菌標準菌株、腸炎沙門氏菌標準菌株、糞腸球菌標準菌株均為河南省獸藥飼料監察所實驗室購買保存。

1.2 培養基與試劑 LB肉湯、菌落計數培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司；細菌DNA提取試劑盒，購自天根生化（北京）有限公司；PCR預混酶（2×Flash Hot Start MasterMix，貨號：CW3007M，批號：20347），細菌基因組DNA提取試劑盒（貨號：CW0552，批號：00021304），購自北京康為世紀生物科技有限公司；50×TAE、溴化乙錠，購自索萊寶生物科技有限公司；瓊脂糖，購自西班牙BIOWEST公司。

1.3 主要儀器設備 PCR擴增儀，購自美國Applied Biosystems公司；凝膠電泳儀，購自美國Bio-Rad公司；凝膠電泳成像系統，購自Alphainnotech Corporation公司；電子天平（BS2002S），購自北京賽多利斯儀器公司；生物安全柜，購自美國Thermo公司；離心機，購自德國Sigma公司；水浴鍋，購自金壇市醫療儀器廠；電冰箱，購自青島海爾股份有限公司；超低溫冰箱，購自美國Thermo公司；純水儀，購自Milipore公司；恒溫培養箱，購自上海一恒科技有限公司；濁度儀，購自無錫市光明濁度儀廠；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，購自日本三洋公司。

2 方 法

2.1 引物設計 根據GenBank提供的CTX-M、mcr-1、floR基因及其亞型基因序列，利用DNAStar軟件進行同源性分析，確定每個基因同源性高的保守區域作為耐藥基因的擴增靶序列，用 Primer Premier 5.0軟件進行引物設計，引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。引物序列及預期擴增片段長度見表1。

表1 引物序列及擴增片段長度Tab 1 Primer sequence and amplified fragment length

2.2 大腸桿菌模板DNA的制備 參照試劑盒說明書提供的步驟，利用細菌基因組DNA提取試劑盒，提取大腸桿菌基因組DNA，-20℃冰箱保存備用。

2.3 單基因PCR的擴增及測序 選用耐藥基因陽性對照菌株模板DNA作為擴增模板，參照常規PCR標準添加量，根據引物的TM值、GC含量等參數，初步確定floR、CTX-M、mcr-1單基因PCR擴增體系及條件，將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將測序結果與Gen-Bank上公布的序列進行同源性比較。

2.4 多重PCR方法條件優化

2.4.1 引物濃度優化 以陽性菌株為模板，各組分濃度和參數均參照常規多重PCR反應的一般原則，在單重PCR基礎上，為了取得引物最佳組合濃度，在預實驗基礎上按三因素五水平L25（53）設計正交實驗表，選取擴增效果較好的一組引物濃度組合，初步確立多重PCR擴增體系。正交實驗方案見表2。

2.4.2 退火溫度優化 在優化引物組合的基礎上，進行退火溫度優化。將退火溫度分別設置為51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃進行PCR擴增，擴增產物用1.5%濃度的瓊脂凝膠進行電泳，用凝膠成像系統對擴增結果進行分析。

2.4.3 循環次數優化 在優化好退火溫度的基礎上，將循環次數分別設置為為30次、31次、32次、33次、34次、35次進行 PCR擴增，擴增產物用1.5%濃度的瓊脂凝膠進行電泳，用凝膠成像系統對擴增結果進行分析。

2.5 多重PCR方法的驗證

2.5.1 多重PCR特異性實驗 分別以陽性對照菌株、大腸桿菌標準菌株、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株、金黃色葡萄球菌標準菌株、單核細胞增生李斯特氏菌標準菌株、志賀氏菌標準菌株、腸沙門氏菌標準菌株、糞腸球菌標準菌株，進行多重PCR的擴增，觀察PCR結果特異性。

2.5.2 多重PCR敏感性實驗 選取10株FloR、CTX-M、mcr-1基因陽性的分離菌株（已經檢測證實），進行多重PCR的擴增，擴增產物用1.5%濃度的瓊脂凝膠進行電泳，觀察多重PCR敏感性。

表2 引物正交試驗方案Tab 2 Primer orthogonal test protocol

2.5.3 多重PCR靈敏度實驗 將陽性對照菌株接種于LB肉湯，37℃過夜培養，調節菌液濃度至0.5 MCF，然后用無菌生理鹽水將菌液遞增稀釋至10-8濃度，分別取1 mL稀釋菌液制備擴增模板，用多重PCR方法進行PCR檢測。同時，選取10-6～10-8稀釋液，取1 mL涂布于菌落計數培養基。根據平板菌落計數結果和多重PCR檢測結果，確定多重PCR靈敏度。

2.5.4 多重PCR重復性實驗 用同批PCR反應試劑，分別在不同時間（間隔7 d）、不同操作條件（包括PCR儀、操作人員）下對同一批陽性菌株（已測序鑒定）檢驗批內重復性檢測。

分別用3個不同批次的PCR反應試劑，對同一批次陽性菌株（已測序鑒定）進行批間重復性檢測。

2.5.5 多重PCR符合性實驗 隨機選取80株豬源大腸桿菌（已分離鑒定），同時采用已發表的Flor［2］、CTX-M［7］、mcr-1［6］基因 PCR 檢測方法與本文建立的多重PCR方法進行耐藥基因的檢測，對檢測結果進行比較分析，檢驗多重PCR的符合性。

2.6 對臨床大腸桿菌樣品的檢測 用優化好的多重PCR方法對河南部分地區豬源大腸桿菌樣品進行檢測（為了方便對大量臨床樣品的檢測，進行了試劑盒提取樣品DNA模板、煮沸法提取DNA、菌液PCR和菌落PCR等提取方法對檢測結果影響的對比試驗）。

3 結果與分析

3.1 單基因PCR擴增和測序結果 根據2.3提供的方法進行單基因PCR擴增，最終在預期目的條帶附近都能擴增出單一目的條帶。其中退火溫度的優化結果為：floR基因最佳退火溫度為57℃，可變范圍為51℃ -60℃；CTX-M基因的最佳退火溫度為57℃，可變范圍為53℃ -60℃；mcr-1基因的最佳退火溫度為56℃，可變范圍為53℃ -59℃；對3個目的基因片段進行測序，分別進行序列比對分析，結果證明擴增片段均為目的基因的片段。

3.2 多重PCR方法條件優化

3.2.1 引物濃度優化結果 按照 2.4.1 的方法，將3對引物進行組合后進行PCR擴增，結果如圖1。結果顯示，組合13的擴增效果最好，即floR、CTX-M、mcr-1 的添加量分別為 0.3、2、0.7 μL時，擴增效果最好。

3.2.2 退火溫度優化結果 根據2.4.2 的方法調整退火溫度，用凝膠成像系統對擴增結果進行分析，見圖2。結果顯示，在55℃ ～58℃均能進行高效的擴增，最終，選取57℃為最佳退火溫度。

3.2.3 循環次數優化結果 根據 2.4.3 的方法，在退火溫度優化完畢的基礎上，進行循環次數的優化，循環次數優化結果，見圖3。根據結果，在33次、34次、35次循環時均有比較好的擴增結果，結合擴增時間雙重條件，選擇34次循環為最佳循環次數。

根據全部優化結果最終確定多重PCR反應體系，見表3。

3.3 多重PCR方法驗證

3.3.1 多重 PCR 特異性實驗結果 按照2.5.1 所述的方法，對上述菌株進行PCR擴增，結果見圖4。圖中可以看出，只有陽性菌株擴增出了3條特異性目的條帶，其他標準菌株的模板均沒有擴增出來。說明本方法具有很高的特異性。

圖1 部分引物組合的PCR產物凝膠電泳結果Fig 1 PCR product electrophoresis results of partial primer combinations

圖2 不同退火溫度的PCR產物凝膠電泳結果Fig 2 Results of gel electrophoresis of PCR products at different annealing temperatures

圖3 不同循環次數的PCR產物凝膠電泳結果Fig 3 Results of gel electrophoresis of PCR products with different cycle times

表3 多重PCR擴增體系Tab 3 Multiplex PCR amplification system

3.3.2 多重 PCR 敏感性實驗結果 根據2.5.2 所述的方法，對實驗菌株進行PCR擴增，結果見圖5。結果顯示，10株已知floR、CTX-M、mcr-1基因陽性的分離菌株，均能擴增出3條特異性條帶。說明本方法具有很高的敏感性。

3.3.3 多重 PCR 靈敏度實驗結果 按照2.5.3 所述的方法進行實驗，平板菌落計數結果表明，在10-6稀釋度時，平板上長有146個菌落，由此可以得出0.5 MCF 的原菌液濃度為1.46 ×108CFU／mL；多重PCR實驗結果（見圖6）表明，在10-3稀釋度時仍能擴增出3條特異性條帶，此時的菌液濃度為1.46×105CFU／mL，即平均每毫升PCR反應體系中有1.46×105個細菌存在時，3個耐藥基因全部能夠被檢測出來，說明本方法具有很好的靈敏度。

圖4 特異性實驗電泳圖Fig 4 Specific experimental electropherogram

圖5 敏感性實驗電泳圖Fig 5 Sensitivity experiment electropherogram

3.3.4 多重 PCR 重復性實驗結果 根據2.5.4 的方法，進行批間和批內重復性實驗，結果分別見表4和表5，結果顯示，批間和批內重復性結果均一致，說明本方法具有良好的重復性。

表4 批內重復性試驗結果Tab 4 Repetition test result of within the batch

圖6 靈敏度實驗電泳圖Fig 6 Sensitivity experimental electropherogram

表5 批間重復性試驗結果Tab 5 Repetition test result of in batches

3.3.5 多重 PCR 符合性實驗結果 根據2.5.5 的方法對80株分離菌進行PCR的擴增，比較單重PCR和本文建立的多重PCR結果，得出如下結果：floR基因有2個樣品結果不一致（符合率為97.5%）；CTX-M有2個樣品的結果不一致（符合率為97.5%）；mcr-1有1個樣品的結果不一致（符合率為98.8%）。符合率均為98%左右。

3.4 對臨床大腸桿菌樣品的檢測 用優化好的多重PCR方法對河南部分地區的豬源大腸桿菌進行檢測（經過不同提取方法對檢測結果影響的對比發現，菌液PCR和菌落PCR均有良好的檢測結果，鑒于菌液PCR和菌液PCR更方便快捷，本文在檢測臨床樣品時選取菌液PCR的方法），調查了該地區100株豬源大腸桿菌分離株的floR、CTX-M、mcr-1基因的攜帶情況，進一步驗證了該方法的實用性。檢測結果表明，floR基因檢出率為75.0%，CTX-M檢出率為18.0%，未檢出mcr-1基因。

4 討論與結論

目前在耐藥基因的檢測方面，主要還是以單重PCR檢測為主，單重PCR每次只能檢測一種耐藥基因，耗時費力，而目前建立的多重PCR方法，也多以同一類藥物耐藥基因的檢測為主，如田國寶等［8］建立的三重PCR檢測方法，針對的是大腸桿菌β-內酰胺酶的耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M。本研究更好的結合臨床藥物使用情況，選取臨床常用抗生素的主要耐藥基因，建立了多重PCR檢測方法，為臨床上篩選大腸桿菌的敏感抗生素提供技術支撐。

本研究中對臨床樣品的檢測結果顯示，floR基因檢出率為75.0%，這一結果與包義斐［9］2017年的研究結果相吻合，說明河南地區對氟苯尼考的耐藥性嚴重；本研究中CTX-M的檢出率為18.0%，與楊守深等［10］在福建地區的18.0%的檢出率結果一致；隨著農業農村部2016年公布的2428號公告的實施，禁止硫酸粘桿菌素作為飼料添加劑用于促進動物生長使用，本研究中并未檢出大腸桿菌對粘桿菌素的耐藥基因mcr-1。

需要指出的是，本研究建立的多重PCR檢測方法是基于我國目前獸醫臨床用藥習慣以及各耐藥基因流行特點設計的，隨著抗生素的繼續使用，可以預見我國的動物源大腸桿菌耐藥基因也會隨之發生改變。因此，研究人員有必要持續跟蹤耐藥基因的分子流行病學變化，以及臨床用藥習慣的改變，適時調整PCR檢測方法的靶基因和各反應體系參數，使之能更準確有效的服務于臨床。

通過對PCR條件的優化，建立了豬源大腸桿菌中對臨床常用藥物氟苯尼考、頭孢噻呋、粘桿菌素的主要耐藥基因floR、CTX-M、mcr-1的多重PCR檢測方法，經驗證，該方法靈敏度為1.46×105CFU／mL，并且具有較高的特異性、穩定性。