聽(tīng)覺(jué)研究中NKCC1與Na+-K+-ATPase 在耳蝸K+循環(huán)中的作用研究

錢 迪 鄭偉昌 陳翠霞 敬光懷 湯國(guó)棟 黃俊煊

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 深圳 518109）

耳聾是臨床常見(jiàn)的聽(tīng)力損傷類型，近年來(lái)隨著臨床醫(yī)學(xué)對(duì)該病病理機(jī)制研究的不斷深入，諸多文獻(xiàn)研究報(bào)道從遺傳、環(huán)境、病理及藥物等因素探討了其發(fā)病機(jī)制。據(jù)最新的研究報(bào)道顯示，血管紋是轉(zhuǎn)運(yùn)K+進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴致高鉀環(huán)境形成，并促使耳蝸內(nèi)電位（EP）產(chǎn)生的主要部位[1]；而相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示，在大鼠耳蝸中鈉鉀氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（NKCC1）、Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase） 主要于血管紋邊緣細(xì)胞基礎(chǔ)膜側(cè)分布，在維持內(nèi)耳聽(tīng)力中發(fā)揮了重要的參與作用機(jī)制[2]。且NKCC1及Na+-K+-ATPase 離子轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)建立起的耳蝸K+循環(huán)是EP產(chǎn)生的重要條件。C57BL/6J小鼠是已經(jīng)證實(shí)的具有典型特征的聽(tīng)力損傷動(dòng)物模型，本研究主要分析NKCC1與Na+-K+-ATPase 在耳蝸K+循環(huán)及中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料：選擇由動(dòng)物中心提供的36只健康C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，小鼠經(jīng)近交自行繁殖培育，可保持長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的聽(tīng)力，均系小鼠12周齡，體質(zhì)量12～18 g，平均（15.32±4.26）g。所有試驗(yàn)小鼠均放置低噪聲環(huán)境下進(jìn)行普通飼養(yǎng)。

1.2 方法：①聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)。取實(shí)驗(yàn)鼠12只，予以三溴乙醇腹腔注射麻醉，用量0.53 mg/g；采用銀針電極，于頭頂正中皮下插入正極，于左耳皮下插入?yún)⒖茧姌O，于右耳皮下插入地極電極，ABR檢測(cè)儀器采用美國(guó)產(chǎn)ABR儀，刺激參數(shù)設(shè)置由電腦產(chǎn)生設(shè)定的短聲、短純音的8、16、32 kHz為刺激聲。實(shí)驗(yàn)中以能分辨出ABR I波的最低刺激強(qiáng)度作為ABR閥值，ABR檢測(cè)3次，取平均值，作正常對(duì)照組[3]。②NKCC1抑制劑實(shí)驗(yàn)及恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)鼠12只，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后，給予NKCC1抑制劑呋塞米注射，注射30 min后再予以ABR檢測(cè)，作為呋塞米實(shí)驗(yàn)組。12只小鼠停藥3 d，后再次行ABR檢測(cè)，作為呋塞米恢復(fù)組。③Na+-K+-ATPase抑制劑實(shí)驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)鼠12只，予以腹腔內(nèi)注射麻醉后，給予Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因注射，1次/天，連續(xù)注射5 d。第5天注射30 min后再予以ABR檢測(cè)，作為哇巴因?qū)嶒?yàn)組。12只小鼠停藥3 d，后再次行ABR檢測(cè)，作為哇巴因恢復(fù)組。

1.3 觀察指標(biāo)：通過(guò)1.2檢測(cè)結(jié)果，對(duì)比分析對(duì)照組、呋塞米實(shí)驗(yàn)組、呋塞米恢復(fù)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組、哇巴因恢復(fù)組小鼠ABR閥值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件版本號(hào)為SPSS20.0，用（±s）的形式對(duì)計(jì)量檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行表示，數(shù)據(jù)之間的比較用t對(duì)其進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05提示數(shù)據(jù)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠ABR閥值比較：從表1可以看出，在平均ABR閥值指標(biāo)值上，給藥前，對(duì)照組、呋塞米實(shí)驗(yàn)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥后，呋塞米實(shí)驗(yàn)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組平均ABR閥值均高于給藥前（P＜0.05），與正常對(duì)照組接近。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠ABR閥值比較（±s）

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠ABR閥值比較（±s）

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2.2 實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥前后ABR閥值比較：從表2可以看出，停止給藥恢復(fù)后，呋塞米實(shí)驗(yàn)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組平均ABR閥值均低于給藥后（P＜0.05），與給藥前接近。

表2 實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥前后ABR閥值比較（±s）

表2 實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥前后ABR閥值比較（±s）

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3 討 論

本研究主要研究聽(tīng)覺(jué)實(shí)驗(yàn)中NKCC1與Na+-K+-ATPase 在耳蝸K+循環(huán)中的作用，其中NKCC1是參與耳蝸K+循環(huán)生理機(jī)制，對(duì)聽(tīng)覺(jué)生理功能進(jìn)行維護(hù)的重要功能通道[4]；Na+-K+-ATPase會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)外的Na+濃度差，當(dāng)Na+經(jīng)該濃度差于細(xì)胞進(jìn)入時(shí)，可經(jīng)本體蛋白質(zhì)運(yùn)載體以共同運(yùn)輸?shù)姆绞綄⑼ㄟ^(guò)細(xì)胞膜不易的物質(zhì)帶進(jìn)細(xì)胞。如前文所述，血管紋是轉(zhuǎn)運(yùn)K+進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴致高鉀環(huán)境形成，并促使耳蝸內(nèi)電位（EP）產(chǎn)生的主要部位，而在血管紋邊緣細(xì)胞底側(cè)膜的NKCC1與Na+-K+-ATPase在耳蝸K+循環(huán)中則發(fā)揮著重要的作用機(jī)制[5]。其中Na+-K+-ATPase通過(guò)3 Na+的泵出，以交換2K+轉(zhuǎn)運(yùn)至邊緣細(xì)胞，促使Na+濃度梯度的形成；NKCC1則可通過(guò)對(duì)內(nèi)向性Na+濃度梯度的利用以1 Na+：1K+：2Cl-的比例將離子轉(zhuǎn)運(yùn)至邊緣細(xì)胞。而經(jīng)邊緣細(xì)胞頂膜上的KCNQ1通道將K+分泌至淋巴，進(jìn)而形成EP，對(duì)聽(tīng)覺(jué)功能進(jìn)行維持[6]。與此同時(shí)，分泌至耳蝸內(nèi)淋巴中的K+經(jīng)基底膜毛細(xì)胞與螺旋韌帶間的通道進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，再次進(jìn)入邊緣細(xì)胞，以此循環(huán)，構(gòu)成耳蝸K+循環(huán)機(jī)制。因此，血管紋邊緣細(xì)胞底側(cè)膜的NKCC1與Na+-K+-ATPase對(duì)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)具有限制與促進(jìn)作用[7]。

本研究通過(guò)構(gòu)建動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)試驗(yàn)，以健康C57BL/6J小鼠為研究對(duì)象，分別設(shè)置正常對(duì)照組，NKCC1抑制劑呋塞米實(shí)驗(yàn)組、恢復(fù)組，Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因?qū)嶒?yàn)組、恢復(fù)組。結(jié)果顯示：①在平均ABR閥值指標(biāo)值上，給藥后，呋塞米實(shí)驗(yàn)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組平均ABR閥值均高于給藥前（P＜0.05），與正常對(duì)照組接近。即通過(guò)對(duì)NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的抑制，小鼠ABR閥值顯著升高。②停止給藥恢復(fù)后，呋塞米實(shí)驗(yàn)組、哇巴因?qū)嶒?yàn)組平均ABR閥值均低于給藥后（P＜0.05），又與給藥前接近。提示，通過(guò)對(duì)NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的恢復(fù)，小鼠ABR閥值顯著降低，且接近正常。上述兩項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)NKCC1與Na+-K+-ATPase作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其活性與小鼠聽(tīng)覺(jué)功能密切相關(guān)。當(dāng)小鼠被注入NKCC1抑制劑呋塞米后，耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞底側(cè)膜上分布的NKCC1活性被阻斷，其在耳蝸K+循環(huán)中所發(fā)揮的作用降低，對(duì)K+由邊緣細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至淋巴，再由淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)至邊緣細(xì)胞的循環(huán)路徑進(jìn)行阻斷，致高鉀環(huán)境破壞，EP建立受阻，從而導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)功能障礙，ABR閥值升高[8]。同時(shí)，當(dāng)小鼠被注入Na+-K+-ATPase抑制劑哇巴因后，耳蝸側(cè)壁螺旋韌帶纖維細(xì)胞膜上分布的Na+-K+-ATPase活性被阻斷，其在耳蝸K+循環(huán)中所發(fā)揮的作用降低，K+不能泵入，進(jìn)入邊緣細(xì)胞受阻，造成進(jìn)入淋巴的K+大量減少，EP建立受抑制，同樣引發(fā)聽(tīng)覺(jué)功能障礙，ABR閥值升高。另一方面，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道證實(shí)，NKCC1與Na+-K+-ATPase活性與耳蝸神經(jīng)變性密切相關(guān)。即NKCC1與Na+-K+-ATPase活性的降低，損傷耳蝸微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，使血管基底膜厚度增加，造成微血管供應(yīng)區(qū)神經(jīng)缺氧、缺血、神經(jīng)脫髓鞘及髓鞘空泡樣改變，這是誘發(fā)耳蝸和耳蝸神經(jīng)變性的重要因素，不僅可造成聽(tīng)覺(jué)功能受損，同時(shí)也是引起耳聾的主要原因。綜上，NKCC1與Na+-K+-ATPase作為離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其開(kāi)展的離子轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)是建立耳蝸K+循環(huán)，產(chǎn)生EP及維持聽(tīng)覺(jué)功能的重要因子。