乙型流感病毒抗原快檢試劑應用評估

李艷宇 李姍姍 高鵬 彭曉旻

流感病毒依據內部核蛋白(NP)與基質蛋白(MP)的抗原性差異，可被分為甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)三個型。甲型和乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，是引起人群呼吸道感染的主要病原體。乙型流感病毒雖然未造成過流感大流行，但同甲型流感病毒一樣每年在全球季節性流行，導致了各地的局部流行，并能引起重癥和死亡病例，在某些特定情況下所導致的疾病負擔甚至超過甲型流感病毒[1-3]。乙型流感病毒屬于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，本研究用乙型流感病毒快速檢測方法與實時熒光參考方法進行比較，擬評估乙型流感病毒快檢試劑盒在基層醫療機構的適用性及應用效果，為臨床推廣提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1評估樣本來源 2015年10月-2017年5月，以北京市東城區疾病預防控制中心(CDC)收集到的216例流感樣病例的咽拭子標本作為本次評估的臨床樣本，其中，流感樣病例定義為發熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。

1.2標本采集、保存和運輸 用無菌咽拭子在患者咽后壁左右擦拭至少2次，然后將其放置病毒采樣管中，4 ℃條件下運輸。24 h內進行檢測則放置2～8 ℃條件下，超過24 h檢測則需要放置-80 ℃凍存。

1.3評估試劑及操作步驟 乙型流感病毒抗原檢測試劑盒(免疫滲漏法)為北京萬泰生物公司產品(貨號為：Flu-0330)。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。操作過程中應注意：(1)在樣本處理時，加入裂解液后一定要充分混勻，使樣本充分裂解。(2)加酶標試劑后一定要等酶標試劑完全滲入后再靜置2 min進行下一步操作，使酶作用時間充足。

1.4參照方法及檢測流程 以中國疾病預防控制中心推薦的乙型流感病毒實時熒光PCR方法作為對照方法。檢測流程：(1)引物與探針序列：FluB-F：TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG；FluB-R：CGGTGCTC-TTGACCAAATTGG；FuB-P：CCAATTCGAGCAGCTGAA-ACTGCGGTG。(2)體系配制采用QIAGEN的Quantitect?Probe RT-PCR kit：貨號為204445。(3)上機程序：設置FAM熒光通量，反轉錄50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15Sec、60 ℃ 60Sec(40個循環，并在60 ℃收集熒光)。(4)結果判讀標準：以陰性對照的擴增曲線作為基線調整依據，閾值循環數Ct(cycle threshold)值<30為陽性；Ct值>32為陰性；Ct值在30～32之間為灰區，重新檢測后Ct值仍在30～32之間判為陽性。

1.5分析方法 臨床試驗采用樣本隨機盲法排序。(1)在測定過程中，對同一份標本分別用乙型流感病毒抗原快檢試劑盒(免疫滲漏法)和參照方法平行測定，分別記錄實驗結果。(2)將兩種檢測方法均為陽性且Ct值較低(Ct值>29)的樣本按照10倍梯度稀釋10-1～10-4，然后再用快檢方法與參考方法分別對各個稀釋度的樣本進行平行測定，分別記錄實驗結果。

1.6統計學方法 采用醫學統計學2×2列聯表，用SAS 9.3統計軟件對數據進行Kappa值檢驗，評價快檢方法與參考方法的一致性(Kappa值為內部一致性系數，是評價診斷試驗方法與金標準一致性指標。判別標準為：Kappa值≥0.75說明兩個判斷值具有良好的一致性； Kappa值>0.4，說明兩個判斷值一致性尚可； Kappa值≤0.4說明兩個判斷值一致性較差；)，兩種檢測方法間的差異用Fisher檢驗；同時評價快檢試劑的靈敏度、特異性、總符合率指標。靈敏度=真陽性份數/(真陽性份數+假陰性份數)×100%，特異性=真陰性份數/(真陰性份數+假陽性份數)×100%，總符合率=(真陽性份數+真陰性份數)/總份數×100%。

2 結果

2.1快檢方法與參考方法檢測結果的比較 用乙型流感病毒快檢方法與實時熒光參考方法同時檢測臨床216份流感樣病例樣本，統計結果顯示 Kappa值為0.91，表明兩種檢測方法的一致性良好，Fisher檢驗P=8.44E-17，P<0.001，兩種檢測方法差異有統計學意義。其中快檢方法的靈敏度為84.62%(11/13)，特異性為100%(203/203)，總符合率為99.07%(214/216)。兩種方法均表現為陽性的人數為11份(8份為快檢陽性參考方法檢測Ct值<30，3份為快檢陰性參考方法檢測兩次Ct值都在30～32之間)，有2份樣本快檢方法檢測為陰性而參考方法檢測為陽性(參考方法兩次檢測Ct值都在30～32之間,表1)。

2.2快檢方法與參考方法檢測限度的比較 兩種檢測方法均為陽性且Ct值較低(Ct值>29)的5份流感樣病例樣本稀釋后再用乙型流感病毒快檢方法與實時熒光參考方法同時檢測，結果顯示有4份樣本檢測陽性限度相差10倍，1份樣本檢出陽性限度相差100倍，第5件樣本在稀釋度為10-3時兩種檢測方法均為陰性(其樣本Ct值最高為31.57,表2)。

表2 快檢方法與參考方法檢測限度比較

注：“+”表示檢測結果為陽性；“-”表示檢測結果為陰性。

3 討論

3.1結果發現，乙型流感病毒快速檢測試劑與實時熒光PCR檢測方法比較，也能高特異、高敏感地檢測出乙型流感病毒感染，并且與對照試劑有著較高的符合率，說明乙型流感病毒快檢試劑也可以滿足乙型流感病毒臨床檢測的一般需要。本研究中雖然只有2份樣本呈現假陰性結果，但由于近幾年乙型流感病毒病例相對較少，只有13份陽性樣本，所以漏檢率較高，靈敏度相對較低，防止出現這種偏倚的方法一方面需要選擇在乙型流感流行的年度加大檢測樣本，提高乙型流感病毒的陽性率，另一方面是快檢試劑本身質量的優化，縮短樣本裂解時間，降低樣本檢出濃度限度，提高試劑的靈敏度和特異性。

3.2由于無合適的方法對樣本中病毒載量進行絕對定量，只能對原始樣本進行相應的梯度稀釋后再用兩種方法同時進行檢測，以評估快檢方法的檢測限度。通過檢測結果發現，快檢方法與參考方法的檢測限度一般只相差10倍(只有一份樣本相差100倍)，說明快檢方法的檢測限度也較低，與普通PCR方法相當[4-7]。但快檢試劑對樣本的檢出限度值與參考試劑檢測樣本的Ct之間是否存在線性關聯還需要進一步研究。

與參考試劑相比，快檢試劑有著檢測時間短、操作簡單、不需要檢測儀器等諸多優點，其特異性和靈敏度較高，可為臨床醫生對乙型流感病毒感染及病毒性肺炎的病原學診斷、制定診療方案提供幫助。