SRC-3 在犬乳腺癌中的表達及分析

王華南，衛順生，高聰聰，馬 文，裴世敏，楊 旭，張 迪，金藝鵬，林德貴

(1.浙江大學動物科學學院動物醫學系,浙江 杭州310058；2.山西省農業科學院畜牧獸醫研究所,山西 太原030032；3.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀100193)

乳腺腫瘤是母犬最為常見的腫瘤,其發病率約占母犬全部腫瘤性疾病的25%～42%,因此在獸醫臨床上對犬乳腺腫瘤進行明確診斷、治療和判斷預后是從事獸醫行業的人們不懈探索的目標[1]。研究發現,腫瘤組織中的類固醇激素與腫瘤的預后、化療耐藥性等密切相關[2]。

類固醇激素通過與ER、PR、AR、GR 等在內的類固醇受體結合,進而調控乳腺腫瘤的生長[3]。類固醇激素與受體的結合則需要類固醇受體輔助活化因子-3(Steroid receptor activation factor 3,SRC-3)的調控,一旦SRC-3 異常表達,會高度激活下游很多癌基因信號通路的激活,導致腫瘤的發生[4]。

SRC-3 最早在人乳腺癌細胞系中發現,與乳腺癌的發生、惡性程度及預后具有相關性[5、6]。還有研究表明,SRC-3 與卵巢癌、胰腺癌、結直腸癌、前列腺癌、肝癌等惡性腫瘤的發生均密切相關[5,7-9],所以SRC-3 已成為導致腫瘤發生的一個癌基因。而國內外還未見報道SRC-3 在犬乳腺癌中的表達情況,因此本研究有助于我們更好地評價其對犬乳腺腫瘤的預后作用。

1 材料與方法

1.1 動物材料 選取2011 年至2014 年中國農業大學教學動物醫院收集的犬乳腺腫瘤組織,根據WHO 的分類標準,68 例犬組織分為28 例良性乳腺腫瘤、40 例惡性乳腺腫瘤(包括/例淋巴結轉移)。無菌手術器械對腫瘤不同部位進行取材,無菌生理鹽水沖洗后,用十倍體積的4%中性甲醛固定液固定。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗人SRC-3 單克隆抗體工作液(Santa 公司)；克隆系C-10；DAB 顯色試劑盒和PV-9000 通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；自動脫水機、半自動石蠟包埋機、手動切片機、恒溫展片機(英國Shandon 公司)。

1.3 試驗方法 對所有收集到的乳腺腫瘤組織進行SRC-3 免疫組織化學染色。免疫組織化學染色方法參照文獻。簡要步驟如下:將上述固定的乳腺組織用組織包埋機進行石蠟包埋；每個石蠟組織至少制備2 張3 μm 的切片；第一張切片制備H&E,進行病理學分類；另一張組織切片經過脫蠟、水化、修復抗原、封閉、加一抗、加二抗、顯色等過程完成SRC-3 的免疫組織化學染色。

1.4 結果判定標準及分析方法 SRC-3 表達以細胞核出現黃褐色為陽性反應。在400 倍顯微鏡下觀察并計數。根據染色細胞占比例可分為5 級。0分:＜5%,1 分:5%～25%,2 分:26%～50%,3 分:51%～75%,4 分:＞75%。根據顯色程度判斷陽性強度:標本無著色為0 分；淡黃色為1 分；棕黃色為2 分；棕褐色為3 分。 兩者分數乘積0 ～2 分為(-)；3-4分為(+)；6 ～8 分為(++)；8 分以上為(+++)。“-”與“+”為低表達,“++”與“+++”為高表達。每份切片計分=細胞染色數分數×染色強度分數,所得分數＜1 為陰性結果,反之為陽性。

采用SPSS 11.0 及PPMS 1.5 統計學軟件進行數據處理,數據間比較采用卡方檢驗和H 檢驗,相關性采用Spearman 等級相關分析。P ＜0.05 為統計學顯著性差異。

2 結果

如中插彩版圖1(A 和B)中所示,SRC-3 主要表達于細胞核,少部分在細胞質中表達。SRC-3 在41例乳腺癌中均有表達,但表達的程度有較大差異。惡性乳腺腫瘤的表達率為77.5%高于其他類型的乳腺組織(35.7%),表達情況有一定差異(見表1)。

3 討論

SRC 家族是輔助激活因子的一類,目前已知的包括3 種:SRC-1、SRC-2、SRC-3。SRC-3 是最先在乳腺癌中發現的一種基因,它在很多的組織中都有表達,但在乳腺和卵巢中的表達量最高[5]。它以配體依賴的形式與核受體相互作用,通過受體的甲基化反應或乙酰基化反應以及其他一些輔助因子的參與來提高核受體基因的轉錄活性[4]。SRC 蛋白家族主要對類固醇受體如雌激素受體、孕激素受體、甲狀腺素受體以及糖皮質激素受體等發揮轉錄調節作用,對機體的生長、發育以及生殖具有重要的影響[4]。人類研究證實,SRC-3 蛋白表達與肌層浸潤深度具有明顯的相關性,說明過度表達的SRC-3 可能參與細胞的異常生長增殖,對腫瘤的形成及其局部侵襲能力具有一定的促進作用[10-11]。因此我們可以認為,腫瘤組織中SRC-3 表達水平越高,其深肌層浸潤的可能性越大,因為肌層浸潤深度是乳腺腫瘤預后不良的因素之一,可以結合其他預后不良的高危因素綜合判斷預后及指導臨床治療。

表1 SRC-3 的表達情況

人類癌癥研究中發現,SRC-3 蛋白在ER 陽性的乳腺腫瘤中的表達量明顯地高于ER 陰性的乳腺腫瘤,說明雖然SRC-3 蛋白的異常表達能夠通過多種途徑導致腫瘤的發生,但在雌激素敏感的乳癌腫瘤中,雌激素受體途徑應該在腫瘤的癌變過程中發揮重要作用[12]。我們只研究了SRC-3 在犬乳腺腫瘤中的表達情況,并且SRC-3 主要在惡性乳腺癌中高表達,主要表達于乳腺細胞質和細胞核中,而我們本次試驗并未分析SRC-3 與ER 之間的關系,但并未我們將來研究SRC-3 與ER 所涉及的信號機制做了基礎工作。

SRC-3 在犬正常組織中無表達,但是在腫瘤組織中有表達,其中SRC-3 在部分惡性腫瘤表達明顯,適用于作為早期判斷惡性程度指標及預后指標；篩選出SRC-3 強表達的乳腺腫瘤組織對于后續的研究可能有一定的意義。