氟苯尼考脅迫對土壤細菌耐藥性的影響

牛金利，彭金菊，明月月，吳 群，馬 驛

(廣東海洋大學農學院動物醫學系,廣東 湛江524088)

氟苯尼考(Florfenicol)又稱為氟甲砜霉素,是一種動物專用的廣譜抗生素,在酰胺醇類藥物中其抗菌活性優于氯霉素及甲砜霉素,特別對一些耐氯霉素及甲砜霉素的大腸桿菌、沙門菌、克雷伯菌仍表現出較高的抗菌活性。氟苯尼考被廣泛用于預防或治療家畜的細菌感染性疾病,主要用于敏感細菌所致的豬、雞及魚的細菌性疾病,尤其對呼吸系統感染和腸道感染療效顯著[1]。近年來,由于抗菌藥的大量使用和濫用,動物源性致病菌和環境細菌的耐藥率逐漸上升,多重耐藥現象也日益嚴重[2-3]。Goni[4]在對187 株沙門菌的耐藥性進行檢測時發現,有103 株具有多重耐藥性。相關研究認為,獸用抗生素的大量使用,不僅影響環境中微生物的數量和功能,而且會使細菌產生耐藥性基因并遺傳,造成環境生態結構的改變,從而使土壤、水等環境中的耐藥細菌種類和數量不斷增加[5-6]。 本試驗通過在土壤中添加不同濃度的氟苯尼考,分離培養土壤細菌,采用微量肉湯二倍稀釋法測定氟苯尼考對土壤優勢細菌的敏感性,同時采用藥敏紙片擴散法測定用藥前后分離的氟苯尼考敏感菌和耐藥菌對18 種抗菌藥物的敏感性,進而了解氟苯尼考對土壤優勢細菌耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 土壤:采自廣東海洋大學校內菜地10 ～20 cm 的優質土壤。經檢測不含氟苯尼考。氟苯尼考:含量98%,華北制藥股份有限公司(批號13021322)。藥敏紙片:鏈霉素、阿奇霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、頭孢唑啉、丁胺卡那霉素、復方新諾明、利福平、多西環素、青霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、紅霉素、克林霉素、卡那霉素、苯唑西林、大觀霉素、呋喃唑酮,杭州馳成醫藥科技有限公司。培養基:LB 固體培養基、LB 液體培養基,北京凱歐迪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 土壤處理與分組 采集的土壤過4 mm 篩,陰干后按每組2.5 kg 分裝于塑料桶內,共5 組,加入氟苯尼考使各組土壤中的藥物濃度分別為:Ⅰ組0 mg/kg、Ⅱ組0.1 mg/kg、Ⅲ組1 mg/kg、Ⅳ10 mg/kg、Ⅴ組100 mg/kg,每組3 個重復。調節土壤含水量至田間最大持水量的50%,用透氣紗布覆蓋,25 ℃±3 ℃的室溫下培養。

1.2.2 樣品的采集 在用藥后第14 天、28 天、56天分別從各組中采集土壤用滅菌蒸餾水進行倍比稀釋,制備細菌懸液。具體稀釋方法:取10 g 土壤樣品于250 mL 錐形瓶中,加入90 mL 滅菌水,震蕩搖勻30 min 后取10 mL 懸浮液于另一個250 mL 的錐形瓶中,再加入90 mL 的滅菌水,以此類推,依次稀釋到適宜的濃度。

1.2.3 細菌的分離、培養 將上述制備好的不同濃度的細菌懸液各取0.1 mL 均勻涂布在LB 固體培養基上,每組涂10 個培養皿,28 ℃培養48 h。觀察細菌生長情況。每組挑取60 株乳白色、半透明、表面較光滑、邊緣整齊、易挑取的中等大小的優勢菌落接種到LB 液體培養基中,28 ℃培養24 h。

1.2.4 氟苯尼考對土壤優勢細菌耐藥性的影響

1.2.4.1 土壤優勢細菌對氟苯尼考的敏感性試驗采用微量肉湯二倍稀釋法測定土壤優勢細菌對氟苯尼考的敏感性。培養24 h 的土壤細菌采用平板計數法計數,用LB 肉湯稀釋至105CFU/mL。取滅菌的96 孔板,于每一排的各孔中加入菌液,在第1孔中加入藥液,然后依次稀釋至第11 孔,第12 孔為不加藥對照,使各排12 個孔的菌液中氟苯尼考含量分別為:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0 μg/mL。稀釋完28 ℃培養24 h 后觀察并記錄結果,每株細菌重復3 次。

1.2.4.2 土壤優勢細菌對其他抗菌藥物的敏感性試驗 取30 株加藥前分離的氟苯尼考敏感菌和用藥后第56 天分離的30 株氟苯尼考耐藥菌,進行對18 種抗菌藥物的敏感性試驗。藥物的敏感性試驗按照美國NCCLS 藥敏試驗紙片擴散法進行:培養過夜的細菌用LB 稀釋至105CFU/mL,吸取0.1 mL 的菌液于LB 固體培養基上,均勻涂布,貼藥敏紙片后28 ℃培養24 h,測定抑菌圈直徑。每種藥物重復3 次。

1.2.5 數據統計與處理 試驗數據采用SPSS20.0統計分析軟件進行單因素方差分析檢驗差異顯著和Excel 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 氟苯尼考殘留對土壤優勢細菌耐藥性的影響 對分離的優勢菌鑒定結果表明,絕大多數菌株為革蘭陰性菌,菌體桿狀或彎曲狀,單個、成對或短鏈狀,水解明膠、淀粉試驗陰性,葡萄糖氧化發酵(O/F)試驗為O(氧化產酸),細胞色素氧化酶試驗陽性,運動性試驗陽性。結合部分細菌基因測序鑒定,培養分離的土壤優勢細菌為芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌。

氟苯尼考對細菌的MIC(最小抑菌濃度)小于或等于加藥前60%細菌的MIC 時,判定該菌株對氟苯尼考敏感。氟苯尼考對分離的菌株的MIC 大于或等于加藥前60%細菌的MIC 的8 倍時,判定該菌株對氟苯尼考耐藥,為耐藥菌株。

通過本試驗可知,氟苯尼考對加藥前分離的優勢細菌中60%以上的菌株的MIC=16 μg/mL,故MIC≤16 μg/mL 的菌株為敏感菌株,MIC≥128 μg/mL 的菌株為耐藥菌株。

氟苯尼考殘留對土壤優勢細菌的耐藥性作用在加藥后第14 天、28 天、56 天分見表1、表2、表3。結果表明,隨著藥物濃度的加大和藥物作用時間的延長,耐藥菌的數量逐漸增多。

表1 用藥后第14 天土壤細菌對氟苯尼考的敏感性試驗結果

用藥后14 d(表1),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數依次 為5、2、7、7、7 株,耐藥率分別為8.33%、3.33%、11.67%、11.67%、11.67%,耐藥率隨藥物濃度逐漸 升高。

表2 用藥后第28 天土壤細菌對氟苯尼考的敏感性試驗結果

用藥后28 d(表2),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數依次為5、4、9、8、14 株,耐藥率為8.33%、6.67%、15%、13.33%、23.33%,耐藥率隨藥物濃度逐漸升高。

表3 用藥后第56 天土壤細菌對氟苯尼考的敏感性試驗結果

用藥后56 d(表3),Ⅰ～Ⅴ組耐藥菌株數依次為6、7、9、15、16 株,耐藥率為10%、11.67%、15%、25%、26.67%,耐藥率隨藥物濃度逐漸升高。

表4 用藥后土壤細菌對氟苯尼考耐藥率的比較

從表4 可以看出,土壤細菌對氟苯尼考的耐藥率分別為:Ⅰ組8.33% ～10%,Ⅱ組3.33% ～11.67%,Ⅲ組11.67% ～15%,Ⅳ組11.67% ～25%,Ⅴ組11.67%～26.67%。表明,隨著時間的延長,在藥物濃度相同條件下,細菌的耐藥率逐漸升高。

2.2 土壤優勢細菌對其他抗菌藥物的敏感性試驗

利用藥敏紙片擴散法測定18 種抗菌藥對用藥前分離的30 株氟苯尼考敏感菌和用藥后56 d 分離的30 株氟苯尼考耐藥菌的抑制情況。試驗結果見表5,在供試的18 種抗菌藥中,氟苯尼考敏感菌對紅霉素、克林霉素、卡那霉素等9 種抗菌藥的敏感性顯著高于氟苯尼考耐藥菌(P ＜0.01)；氟苯尼考敏感菌對頭孢唑林、復方新諾明、多粘菌素B 的敏感性與其耐藥菌差異不顯著(P ＞0.05)；對鏈霉素、利福平等4 種抗菌藥的敏感性與其耐藥菌差異顯著(P ＜0.05)；而苯唑西林和青霉素G 對氟苯尼考敏感菌和耐藥菌無抑制作用(抑菌圈直徑為0 mm)。

3 討論

3.1 氟苯尼考殘留對土壤優勢細菌耐藥性的影響抗生素的大量使用和濫用而引起細菌耐藥的問題已經引起人們的密切關注。范葶莉等[7]通過建立土壤生態模型,發現隨著硫酸黏菌素濃度的逐漸增大,土壤環境中的耐藥菌數量就會增加。彭金菊等[8]在池塘水中加入不同濃度的諾氟沙星,誘導水中的細菌產生耐藥性,結果表明,誘導水中細菌產生耐藥性的諾氟沙星的最低濃度是8 μg/mL。馬驛等[9]研究表明,細菌對恩諾沙星的耐藥率和耐藥水平隨土壤中藥物濃度的加大和時間的延長而明顯增加。本試驗結果表明,土壤中添加氟苯尼考后,土壤優勢細菌對氟苯尼考的耐藥率會隨藥物濃度的加大和作用時間的不斷推移而逐漸增多。細菌耐藥性是靠耐藥基因的水平傳播[10]還是通過質粒進行垂直克隆傳播[11],細菌耐藥性具體的傳播途徑如何,環境細菌的耐藥性是否能傳遞給人源或動物源細菌,還需要更深一步的研究。

表5 抗菌藥對土壤細菌的抑制作用

3.2 土壤優勢細菌的多重耐藥試驗 動物和人類病原菌的多重耐藥現象已經非常普遍,環境細菌的多重耐藥現象也越來越多。李晴等[12]研究從污水處理廠污水中分離的50 株產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌陽性菌株對19 種抗菌藥物的敏感性時發現,其對氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟呈100%的耐藥性；對阿莫西林、復方新諾明、氨曲南等呈一定耐藥性。楊守深等[13]檢測196 株菌對18 種抗菌藥物的敏感性時發現,對青霉素、四環素、紅霉素、氨芐西林、泰樂菌素、阿奇霉素、苯唑西林和萬古霉素高度耐藥。本試驗結果表明,18 種抗菌藥中有9 種藥物對氟苯尼考耐藥菌的敏感性都顯著低于對氟苯尼考敏感的細菌,表明對氟苯尼考耐受的細菌對其他的抗菌藥物也有耐受性,而對多粘菌素B、復方新諾明和頭孢唑啉的差異不顯著,苯唑西林和青霉素G對氟苯尼考敏感菌和耐藥菌均無抑制作用。李琳等[14]發現130 株分離菌中有118 株菌對三種或三種以上的抗生素顯示耐藥,且耐藥率有的高達95%以上。另外,耐藥菌的廣泛傳播是否會通過水、食物、環境污染等傳播給人類或動物引起人們的高度重視。