實驗小鼠糞便中致病性病原微生物檢測與耐藥性分析

楊全中，張 煜，謝永生

(1.新鄉醫學院三全學院基礎醫學院,河南 新鄉453000；2.新鄉醫學院基礎醫學院,河南 新鄉453000)

實驗小鼠是屬于野生鼷鼠變種中鼠屬,是實驗室主要的使用的模式動物之一,在動物傳染病、微生物、藥品等多種研究領域中廣泛應用,實驗小鼠常用的品種是昆明系小鼠,為科學研究工作提供可靠的支持[1-3]。動物糞便中含有多種有害物質,成為了生物污染的重要來源之一,給人類的健康造成嚴重的威脅,成為公共衛生問題[4]。相關研究表明了在每年我國畜禽養殖業中產生的糞便總量為32.64×108t 以上,糞便中含有沙門菌、大腸桿菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等多種病原微生物,糞便處理不當,這些含有病原微生物的糞便流入環境中、水源中,造成嚴重的污染,同時也可以引起其他動物的感染[5-7]。因此,在養殖過程中動物糞便的處理,應該引起重視。病原微生物的攜帶的致病性及耐藥性可以隨著消化道排泄的糞便中,這些病原微生物攜帶的致病性及耐藥性可以通過多種途徑轉移到人的體內,危害人類健康的[6-7]。因此,對實驗小鼠糞便中致病性病原微生物分布與耐藥性具有重要的意義。

本試驗從某市的實驗小鼠養殖基地采集糞便樣品120 份中分離到大腸桿菌、沙門菌、志賀菌3 種病原菌,并對分離的病原菌進行了致病性及耐藥性檢測與分析。為實驗小鼠健康養殖及細菌病防治提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源 從某市的實驗小鼠養殖基地采集糞便樣品120 份,裝入含有無菌的PBS 的采集管中,經過處理進行病原菌檢測。

1.2 主要試劑 大腸桿菌顯色鑒別培養基、S.S.培養基、7%綿羊血培養基、XLD 培養基、普通營養肉湯購自青島海博生物有限責任公司；ID32E 腸道菌鑒定試條、16 種常用的藥敏紙片,均購自杭州天和微生物試劑有限公司；DL-2 000 Marker,購自北京中科瑞泰生物公司、2×Taq Marker Mix,購自北京康為世紀生物科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒,購自北京天根生物科技有限公司；常規的試劑和儀器由本實驗室提供。

1.3 實驗動物 450 只體重22 g 左右的健康的昆明系小鼠由某市的實驗小鼠養殖基地提供。

1.4 分離與鑒定 取無菌的PBS 的采集管中樣品,無菌分區接種于7%綿羊血培養基上,一個樣品一個區,在37 ℃恒溫箱進行擴大培養,并挑取7%綿羊血培養基上單個優勢菌落分別接種于S.S.培養基、XLD 培養基、大腸桿菌顯色鑒別培養基3 種培養基進行鑒別培養,挑取鑒別培養基上的單個菌落接種于營養肉湯中進行純化培養后,進行生化試驗和染色鏡檢。

1.5 生化試驗鑒定 按照ID32E 腸道菌鑒定試條說明書,用全自動細菌生化鑒定系統對純化的菌株進行生化試驗鑒定。

1.6 分離菌株PCR 的檢測與測序 參考文獻[8],根據大腸桿菌、沙門菌、志賀菌保守區基因序列設計特異引物23 Sr RNA 基因、invA 基因和志賀菌ipaH 基因(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按照試劑盒說明書提取分離菌株的基因組DNA,以提取的分離菌株的基因組DNA為模板,進行PCR 鑒定,并將分離菌株的PCR 擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序,分離菌株的測序結果與GenBank 數據庫中登錄參考株的基因序列進行同源性比較。見表1。

表1 引物序列

1.7 動物致病性試驗 參照文獻[9],進行動物致病性試驗。將取純化培養的分離株培養至對數期進行計數,每株分離菌株灌胃攻毒5 只小鼠,劑量為0.25 mL(1×108CFU/mL),對照組給予等量的無菌的PBS。攻毒12 h 后觀察6 d 并記錄每組小鼠的死亡情況,并進行病原菌鑒定。

1.8 藥敏試驗 分離菌株的藥敏試驗參照用美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B 紙片法進行,按照CLSI 的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷,分析耐藥性分析。

2 結果

2.1 分離培養結果 疑似沙門菌在S.S.瓊脂培養基長出了半透明,圓形的、個別的中間帶有黑色心的菌落,分離菌株革蘭染色為陰性、兩端略圓的小直桿狀。疑似志賀菌分離菌株在XLD 培養基上長出光半透明的、滑的、圓形、表面光滑的中等大小粉紅色或者無色的菌落。疑似大腸桿菌的分離菌株在大腸桿菌顯色鑒別培養基長出濕潤的、圓形的、大小一致的淺綠色或者綠色的菌落,分離菌株革蘭染色為陰性,呈兩端鈍圓桿狀菌；分離菌株革蘭染色為陰性、呈兩端略圓的短桿狀。

2.2 生化鑒定結果 分離的30 株分離菌株均能發酵枸櫞酸鹽、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇；吲哚試驗呈陰性,個別的菌株產生H2S,被鑒定為沙門菌,評定結果合格率為98.9%～100%；分離的25 株分離菌株均能發酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇,硝酸鹽試驗、M.-R.試驗、枸櫞酸鹽試驗和吲哚試驗均為陽性；尿素酶試驗和V-P 試驗陰性。被鑒定為志賀菌,評定結果合格率為98.9%～99.9%；分離的35 株均能分解甘露醇、葡萄糖、麥芽糖產酸產氣,V-P 試驗呈陰性、吲哚和甲基紅反應為陽性,被鑒定為大腸桿菌,評定結果合格率為99.0%～100%；

2.3 PCR 檢測與測序結果 分離的30 株分離菌株用沙門菌invA 基因引物均擴增出大約為184 bp 大小的目的條帶,分離的25 株分離菌用志賀菌ipaH基因引物均擴增出大約為393 bp 大小的目的條帶,分離的35 株用大腸桿菌23 Sr RNA 基因引物均擴增出大約為652 bp 大小的目的條帶(圖1)。測序結果顯示,30 株分離菌株測序結果與GenBank 庫中登錄的沙門菌參考株基因序列同源性在98.9%～99.9%之間；25 株分離菌株測序結果與GenBank 庫中登錄的志賀菌參考株基因序列的同源性在97.9%～99.9%之間；35 株分離菌株測序結果與GenBank 庫中登錄的大腸桿菌參考株基因序列同源性99.0%～100.0%之間；因而證實了從采集的120份樣品中分離得到了30 株沙門菌、25 株志賀菌、35株大腸桿菌。

圖1 分離菌株PCR 鑒定結果

2.4 致病性試驗結果 在攻毒后的48 ～96 h,攻毒的不同的分離菌株小鼠出現不同程度的死亡,直到試驗結束。從死亡的小鼠的肝臟內分離到了沙門菌、志賀菌、大腸桿菌。對照組的小鼠健康存活,經過統計與分析,24 株為致病性沙門菌、20 株為致病性志賀菌。25 株為致病性大腸桿菌。

2.5 藥敏試驗結果 結果由表2 可知,分離的24株致病性沙門菌、大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氨曲南、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、萬古霉素、多西環素、磺胺間甲氧嘧啶10 種藥物耐藥性比較強,耐藥性在50.0%～100.0%之間,對頭孢噻呋、頭孢曲松 大觀霉素、林可霉素、環丙沙星、恩諾沙星6 種藥物相對較低,耐藥性在16.7%～37.5%之間；分離的20 株致病性志賀菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、大觀霉素、多西環素、鏈霉素、慶大霉素10 種藥物耐藥性較高,耐藥率在65.0%～100%之間,對頭孢噻呋、頭孢曲松、氨曲南、林可霉素、恩諾沙星、環丙沙星6 種藥物耐藥率在10.0%～35.0%之間；分離的25 株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、多西環素、磺胺間甲氧嘧啶9 種藥物耐藥性較高,耐藥率在60.0%～100.0%之間,頭孢噻呋、頭孢曲松、氨曲南、大觀霉素、萬古霉素、恩諾沙星、環丙沙星等8 種藥耐藥率在12.0%～48.0%之間。

表2 分離菌株耐藥性分析結果

3 討論

動物糞中含有細菌、益生菌、噬菌體等多種微生物,糞便中所含的微生物具種類繁多復雜 呈現多樣性化分布、易污染環境等特點,糞便中的一些致病性的病原微生物所攜帶致病因子和耐藥性可以通過多種途徑污染食品傳播給人類,給人類的健康帶來嚴重的威脅[10-11]。相關研究表明了致病性病原菌,如大腸桿菌、沙門菌、志賀菌、葡萄球菌等廣泛存在動物糞便中,同時這些致病病原菌也是引起人們食物中毒的病原菌[13]。本試驗從某市的實驗小鼠養殖基地采集糞便樣品120 份中分離了25 株致病性大腸桿菌、24 株致病性沙門菌、20 株致病性志賀菌。說明了致病性大腸桿菌、致病性沙門菌、致病性志賀菌在某市的實驗小鼠養殖基地的糞便中廣泛存在,應引起重視。大腸桿菌、沙門菌、志賀菌為條件致病菌,當外界條件改變時,有可能引起實驗小鼠發病,在實驗小鼠養殖過程中應該引起重視,勤換墊料、注意環境中的消毒。 李基棕等[14]研究表明了在貴州省養豬場中糞便樣品中分離到了4 種致病菌。文明等[15]研究表明了在豬糞便中分離到大腸桿菌、葡萄球菌和鏈球菌3種病原菌。與本試驗存在一定差異性,可能與宿主有關。

相關研究表明了從糞便中分離的沙門菌、大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等多種致病菌具有很強的耐藥性,且出現多重耐藥性,這些致病菌的耐藥性可以通過環境、畜產品等途徑傳播給人類[13-16]。本試驗研究表明,分離的24 株致病性沙門菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等10 種藥物的耐藥率在50.0%以上,對其他藥物耐藥率在16.7%～37.5%之間；分離的20 株致病性志賀菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等10 種藥物耐藥率在65.0%以上,對其他藥物的耐藥率在10.0% ～35.0%之間；分離的25 株致病性大腸桿菌對氨芐西林、阿莫西林、青霉素等9 種藥物耐藥率在60.0%以上,對其他藥物耐藥率在12.0% ～48.0%之間。說明了從實驗小鼠糞便中分離的病原菌耐藥性嚴重,應該引起重視。國內關于豬糞便中分離的病原菌耐藥性報道較多,關于實驗小鼠糞便中病原菌及耐藥性國內未見報道,有待進一步研究。