天然與人工合成黃酮對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡、壞死的影響

李文強，孫瑞芳，謝穎光，馬金孌，周素梅

(濟寧市第一人民醫院，山東濟寧272100)

心肌細胞功能的維持需要較多的能量，缺血導致的心肌細胞缺糖、缺氧容易造成心肌細胞凋亡和壞死[1]。大量證據表明，心臟缺血再灌注后，心肌細胞的損傷更加嚴重，這種現象稱為心肌細胞缺血再灌注損傷[2,3]。近年來，一些研究表明黃酮類物質能夠保護心肌細胞對抗缺血再灌注損傷[4]。黃酮類物質是由含酚羥基的苯環(A-與B-環)通過中央三碳原子相互連結而成的一大類化合物。槲皮黃酮是一種天然存在的黃酮類物質，廣泛存在于中草藥和一些蔬菜當中。β-萘黃酮是一種人工合成的黃酮類物質。黃酮類物質因其抗細胞凋亡、抗氧化及抗炎作用，近年來引起了廣泛關注[5,6]。2017年6月～2018年12月，本研究觀察了槲皮黃酮和β-萘黃酮對大鼠缺血再灌注心肌細胞調亡、壞死的影響，并對兩種黃酮的作用進行初步比較。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠心肌細胞系H9c2購于美國標準培養中心，接種于DMEM培養基中，加入10%經無菌滅活處理過的進口胎牛血清，將培養基置于37 ℃、5% CO2條件培養箱內進行培養。

1.2 心肌細胞缺血再灌注模型制作及黃酮用法 將細胞分為黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組。黃酮1、2組和模型組參照文獻[7,8]方法構建心肌細胞缺血再灌注模型即糖氧剝奪再恢復(OGD/R)模型：當H9c2細胞生長融合至70%～80%時，將細胞培養基換為DMEM無糖培養基，并放置于低氧培養箱中(氧濃度為0.5%)，創造細胞氧糖剝奪的環境，37 ℃條件下培養24 h；將細胞從低氧培養箱里取出，恢復正常氧濃度，同時換為DMEM正常培養基，在此環境下，繼續培養24 h。黃酮1組造模前向培養基中加入5 μmol/L的槲皮黃酮，黃酮2組加入10 μmol/L的β-萘黃酮。模型組只制作模型，不添加特殊藥物。對照組細胞在正常氧濃度下、DMEM正常培養基中連續培養48 h。

1.3 凋亡細胞檢測 造模結束后使用Annexin V/PI對各組心肌細胞進行雙染，ModFit LT軟件分析，采用雙激光流式細胞儀測算細胞凋亡率。

1.4 細胞中Caspase-3檢測 造模結束后采用Western blotting法檢測各組細胞中裂解的Caspase-3蛋白：提取細胞總蛋白，用二尖酸法對蛋白進行量化，提取的蛋白用10%～15%的SDS-PAGE分離，轉移到硝基膜(EMD)微孔；用TBS-T緩沖液配制的5%脫脂奶粉封閉3 h，或在4 ℃冰箱里封閉過夜；將膜條按順序放置于孵育一抗的盒子中，加入約1 mL抗Caspase；向抗體孵育盒子的加樣槽中加入辣根過氧化物酶標記的抗IgG二抗，孵育2 h。釆用光密度分析儀測定膠片上條帶的平均光密度(IOD)值。以目的蛋白與內參蛋白IOD值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.5 細胞壞死情況觀察 造模結束后收集各組細胞培養基，注入到96孔板中，然后加入乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒中的NAD+/INT/diaphorase配制成的混合液，在室溫下孵育30 min，最后用酶標儀檢測96孔板中490 nm波長處的吸光度值表示LDH水平。以培養基中LDH水平反映細胞壞死情況。

2 結果

2.1 各組細胞凋亡率比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細胞凋亡率分別為11.02%±1.13%、12.75%±1.35%、23.49%±2.14%、9.38%±0.56%。黃酮1組、黃酮2組、模型組細胞凋亡率均高于對照組，黃酮1、2組細胞凋亡率低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統計學意義。見圖1。

注：1為對照組；2為模型組；3為黃酮1組；4為黃酮2組。

圖1 各組細胞凋亡情況

2.2 各組細胞中裂解的Caspase-3表達比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細胞中裂解的Caspase-3相對表達量分別為0.062±0.017、0.066±0.016、0.126±0.03、0.057±0.015。黃酮1組、黃酮2組、模型組細胞中裂解的Caspase-3相對表達量均高于對照組，黃酮1、2組細胞中裂解的Caspase-3相對表達量低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統計學意義。見圖2。

注：1為對照組；2為模型組；3為黃酮1組；4為黃酮2組。

圖2 各組細胞中裂解的Caspase-3表達

2.3 各組細胞培養基中LDH水平比較 黃酮1組、黃酮2組、模型組、對照組細胞培養基中LDH水平分別為(1.82±0.20)、(2.02±0.22)、(7.49±0.54)、(1.24±0.16)μU/mL。黃酮1組、黃酮2組、模型組細胞培養基中LDH水平高于對照組，黃酮1、2組細胞培養基中LDH水平低于模型組(P均<0.05)。兩個黃酮組差異無統計學意義。

3 討論

天然黃酮類化合物雖然廣泛存在于自然界中，但因其結構復雜、水溶性差、生物利用度不高、不易提煉等特點限制了其廣泛應用。因此，以黃酮類化合物為基礎，對其進行結構改造和優化，引入具有不同作用的功能基團，以期研發一批具有更強藥理作用的黃酮類新藥，是該研究領域的一個重要課題。

近年來，黃酮類化合物因其抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用而備受關注。研究發現天然槲皮黃酮能夠抑制缺血再灌注導致的自由基產生，進而抑制缺血再灌注導致的心肌細胞損傷。也有證據表明，人工合成β-萘黃酮通過激活抗氧化酶發揮抗氧化作用，從而防止心肌細胞損傷[9]。目前對于槲皮黃酮在抗氧化、抗凋亡和保護心肌細胞方面的研究較多，而對于β-萘黃酮抗氧化、抗凋亡方面的研究較少。本研究選取天然槲皮黃酮和人工合成β-萘黃酮，探討兩者對缺血再灌注心肌細胞的保護作用，并對兩者保護心肌的作用進行初步比較，為將來藥物開發和臨床應用提供理論依據。研究顯示，5 μmol/L槲皮黃酮、10 μmol/L β-萘黃酮與其各自更高的濃度相比，抗氧化和抗凋亡能力無明顯差異[10]。故本研究中選擇5 μmol/L的槲皮黃酮和10 μmol/L的β-萘黃酮進行實驗。

缺血再灌注后的心肌細胞受到更加嚴重的損傷，大量的心肌細胞發生凋亡，甚至壞死。本研究發現，在缺血再灌注的心肌細胞凋亡率明顯增加，這也說明缺血再灌注對心肌細胞造成嚴重損傷，誘導了細胞凋亡。導致這種現象產生的原因是心肌細胞在缺血再灌注后，細胞中產生了大量的自由基，氧化應激增強，導致心肌細胞結構與功能破壞[11,12]；自由基還能激活細胞內多種細胞凋亡信號分子，最終能夠激活Caspase-3，導致心肌細胞凋亡[13,14]。本研究中黃酮1、2組細胞凋亡率低于模型組，提示黃酮可通過減少細胞凋亡從而減輕心肌細胞的缺血再灌注損傷。

Caspase-3在細胞凋亡過程中起著非常重要的作用，它是細胞凋亡過程中的關鍵執行分子，細胞內多種凋亡信號最后均通過激活Caspase-3，由Caspase-3行使細胞凋亡功能[15]。正常情況下Caspase-3以酶原的形式存在于胞質中，當凋亡信號激活Caspase-3，它被分解為兩個大亞基和兩個小亞基，從而使Caspase-3活化。因此檢測細胞中裂解的Caspase-3可以反映細胞中Caspase-3活化情況，進而了解細胞是否開始凋亡[16]。本研究結果顯示，缺血再灌注的心肌細胞中裂解的Caspase-3表達水平明顯升高，而給予5 μmol/L槲皮黃酮或10 μmol/L β-萘黃酮干預后裂解的Caspase-3蛋白表達水平降低，同時減少了細胞凋亡，與相關研究[17，18]結果一致，提示槲皮黃酮或β-萘黃酮的抗凋亡機制可能與調節Caspase-3表達有關。

LDH存在于活細胞內，而細胞壞死會造成細胞膜結構破壞，導致細胞質內的LDH釋放到培養液里。因此，LDH被看做細胞膜完整性的重要指標，測定培養基中LDH濃度可以用來評估細胞的壞死情況[19]。本實驗結果顯示，缺血再灌注心肌細胞培養基中LDH水平顯著上升，這表明心肌細胞壞死顯著增加。加入5 μmol/L槲皮黃酮或10 μmol/L β-萘黃酮干預后培養基中LDH水平降低，提示槲皮黃酮和β-萘黃酮均能抑制OGD/R誘導的心肌細胞壞死。

結合上述研究結果，我們認為，槲皮黃酮和β-萘黃酮均可減少缺血再灌注心肌細胞的凋亡和壞死。本研究中，黃酮1組與黃酮2組細胞凋亡率、細胞中裂解的Caspase-3相對表達量及細胞培養基中LDH水平差異均無統計學意義。這表明在保護心肌細胞方面，人工合成的β-萘黃酮與天然的槲皮黃酮作用相仿。筆者認為這可能與兩藥的濃度選擇有關，也可能β-萘黃酮的藥理作用優勢并不在抑制細胞凋亡和減輕細胞壞死方面。在下一步的實驗中，我們將對黃酮類化合物的作用機制和劑量進一步探討。