糖尿病腎病相關基因篩選及生物信息學分析

丁煒光，張瑤，李靜波，丁敏

(1天津市南開區三潭醫院，天津300193；2天津醫科大學代謝病醫院)

糖尿病是臨床上最常見的代謝系統疾病[1]，其發病率逐年升高，占用了大量醫療資源和經費[2]。糖尿病腎病(DN)是糖尿病晚期重要的微循環并發癥，也是臨床上終末期腎病的主要原因之一[3]。晚期DN患者出現大量蛋白尿、腎功能衰竭，是糖尿病患者死亡的重要原因。DN的確切發病分子機制并未明確，目前認為DN是涉及多基因、多步驟的異常代謝過程。近年來隨著表達譜芯片及二代測序技術的不斷發展，海量DN相關數據被上傳至多個基因表達數據庫，為從分子層面研究DN提供了基礎[4,5]。對相關基因表達譜芯片中的數據深入分析，探索DN相關基因的信號通路，有助于篩選DN高危人群。本研究采用生物信息技術，分析基因公共表達數據庫(GEO)中關于DN的芯片數據，篩選差異表達基因及其可能的功能和信號通路，以期為DN的早期診斷及靶向藥物研發提供生物信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫及分析軟件 基因表達譜公共數據庫GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)用于篩選DN差異表達基因。本研究中涉及的基因芯片平臺為GPL8300，芯片數據集為GSE1009詳見網址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi acc=GSE1009[6]。生物學信息注釋數據庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)用于對差異表達基因進行生物功能信息注釋。蛋白-蛋白相互作用數據庫STRING(http://string-db.org/cgi/input.pl)用于構建差異表達基因編碼蛋白的相互作用網絡。

1.2 差異表達基因篩選 在GEO中篩選并下載DN相關基因芯片數據，數據搜索條件為“diabetic nephropathy”，物種選擇“human”。利用GEO數據庫提供的在線分析方法篩選出DN患者腎組織與正常人群腎組織中差異表達最為明顯的基因。篩選條件為差異表達上調或下調2倍以上(logFC>2或<-2)、P<0.01。

1.3 差異表達基因功能及信號通路分析 對篩選出的差異表達基因的靶基因進行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEEG)分析，預測其可能功能及信號通路。

1.4 差異表達基因編碼蛋白的相互作用分析 用STRING數據庫分析差異表達基因編碼蛋白間的相互作用關系。分析差異表達基因編碼蛋白與其他常見DN致病基因編碼蛋白之間的相互作用關系。篩選條件為蛋白與蛋白相互作用關系置信指數>0.4。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選結果 篩選出9個差異表達最為顯著的基因，分別為PLCE1、CLIC5、PTPRO、熱休克蛋白A12A(HSPA12A)、AIF1、GMDS、SEMA5A、CEP152、FOXC1。除CEP152表達下調外，余8個基因在DN組表達上調。見表1。

表1 GEO數據庫篩選DN差異表達的基因

2.2 差異表達基因功能與相關通路 層次聚類分析顯示，DN組與對照組呈現出明顯的聚類表達，其中有191個基因呈現明顯的差異表達。GO分析顯示，上述差異表達基因的蛋白產物主要位于細胞膜、細胞器等細胞組成成分，主要的分子功能涉及蛋白結合、對細胞刺激反應和細胞信號轉導，主要調控細胞代謝等生物學過程。KEGG通路分析顯示，差異表達基因主要參與細胞代謝途徑、甲狀腺激素信號通路、Rap1信號通路、磷脂酰肌醇信號系統及肌醇磷酸代謝等。見表2、3。

表2 DN差異表達基因的GO分析結果

表3 KEEG基信號通路分析

2.3 差異表達基因編碼蛋白的相互作用網絡分析結果 在STRING數據庫中分析9個差異表達基因編碼蛋白間的相互作用關系，蛋白網絡分析提示HSPA12A、GMDS、CEP152基因編碼蛋白與其他蛋白作用關聯最緊密(節點度≥5)。

3 討論

DN是臨床上較常見的一類糖尿病微血管并發癥，其病理改變主要為腎小球肥大，腎小管、腎小球基底膜厚度增加，細胞外基質積聚[7～9]；病情進展逐漸出現蛋白尿、血肌酐和尿素氮增高，最終發展為尿毒癥、腎功能衰竭[10]。近年來我國2型糖尿病發病率逐漸增高，DN的患病人數也相應增加[11]。

DN的發病機制復雜，目前仍未完全清楚，現有研究認為DN的發生主要與遺傳背景、腎臟血流動力學異常、血糖升高造成的代謝功能紊亂有關[10～14]。DN相關流行病學研究認為，糖尿病患者一級親屬罹患糖尿病的概率明顯高于非糖尿病人群，且有糖尿病家族史的人群罹患DN的風險也明顯高于無家族史的糖尿病患者。同時，移居非洲的高加索人種DN的發病率高于當地居民，而與移居前所在地的人種發病率相當。上述研究均提示DN的發病存在遺傳因素。

近年來，隨著基因芯片及二代次序技術的不斷進展，積累了大量關于DN的數據，為在分子水平上研究DN的發病、危險因素及靶向治療提供了基礎[9,16,17]。本研究中，筆者借助GEO數據庫篩選了9個在DN患者腎組織與正常人群腎組織中差異表達的基因，進行了功能富集、信號通路和共表達網絡分析。共篩選出9個差異表達最為顯著的基因，分別為PLCE1、CLIC5、PTPRO、HSPA12A、AIF1、GMDS、SEMA5A、CEP152、FOXC1。除CEP152表達下調外，余8個基因在DN組表達上調。這些差異表達的基因蛋白產物主要位于細胞膜、細胞器等細胞組成成分，主要的分子功能涉及蛋白結合、對細胞刺激反應和細胞信號轉導，主要調控細胞代謝等生物學過程。蛋白網絡分析提示HSPA12A、GMDS、CEP152基因編碼蛋白與其他蛋白作用關聯最緊密，提示它們在DN的發病機制中可能發揮重要作用。

HSPA12A、HSPA12B都屬于HSP70超家族。不同于與該家族其他成員，HSPA12B有自己特異的結構和功能。HSPA12B主要表達于血管內皮細胞中，隨著內皮細胞功能障礙及凋亡，外周血中HSPA12B可能升高[18]。DN組中HSPA12B表達水平是對照組的4.19倍，表達水平明顯上調。同時，在DN相關差異表達基因編碼蛋白的相互作用網絡中，HSPA12B基因編碼蛋白為關鍵單蛋白，在整個網絡中與其他蛋白相互作用較為緊密，因此HSPA12B在DN的發生發展中可能發揮重要作用。而關于HSPA12A的研究較少，其確切生物學功能并不清楚。本研究發現HSPA12A為DN的關鍵基因，在DN發生發展中可能發揮重要作用，豐富了HSPA12A的生物學功能，下一步也將就此進行深入探索。

甘露糖-4,6-脫水酶(GDP)由GMDS基因編碼。近年來研究顯示，GDP參與體內的糖代謝過程，其表達水平增高大多與血糖水平升高或異常波動有關[19]。長期較高的血糖水平是DN的發病基礎。本研究中GMDS表達水平在DN組中明顯增高，推測抑制GMDS表達有望成為DN治療的新方向。

目前關于CEP152基因及其編碼蛋白的研究報道較少，且主要為其基因序列報道，具體功能并不清楚[20]。本研究結果顯示CEP152在DN患者中表達水平明顯下調，提示其拷貝數降低或編碼蛋白表達水平下降可能是DN的危險因素。

總之，本研究借助生物信息學方法，篩選出了9個在DN腎組織與正常腎組織中差異表達最顯著的基因，這些基因的主要分子功能涉及蛋白結合、對細胞刺激反應和細胞信號轉導，主要調控細胞代謝等生物學過程。其中，HSPA12、GMDS、CEP152基因編碼蛋白為蛋白-蛋白相互作用網絡的中心節點，提示三者可能是DN相關的關鍵基因，其異常表達可能參與了DN的發病。上述研究結果為DN的早期診斷及靶向藥物研發提供了生物信息學基礎。