泊洛沙姆188對大鼠心肌缺血再灌注損傷的干預作用及其機制

潘雨薇，楊毓雯，黎昱材，羅瓊，柳建華

(1廣州醫科大學附屬市一人民醫院，廣州510180；2華南理工大學附屬第二醫院)

缺血性心臟病是中高收入國家第一大致死性疾病。近幾十年來，溶栓治療、經皮冠狀動脈成形術和冠狀動脈旁路移植術等措施在恢復患者心肌灌注方面起到良好效果。然而，恢復血供后有時會出現缺血部位結構損傷和代謝障礙加重的現象，該現象被稱為心肌缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。MIRI的基本特點包括：損傷的最終關鍵部位不是血細胞或血管壁，而是心肌細胞；損傷部位的病理改變伴隨著細胞膜的破裂；缺血再灌注損傷主要集中在再灌注開始后的前幾分鐘[2]。缺血再灌注誘導Ca2+爆發式釋放、活性氧大量生成和線粒體通透性轉換孔的開放[3～5]。上述過程可對細胞膜產生破壞，其損傷作用包括細胞膜磷脂減少，細胞膜脆性增加，細胞膜上結合的酶活性下降，新的膜離子通道形成，使膜脂質和蛋白質之間、蛋白質和蛋白質之間相互交聯或聚合，從而促進膜損傷、膜脂質過氧化、磷脂酶活化及脂質三聯體對膜結構的破壞[6]。以上提示保護細胞膜可能是從下游減輕MIRI的方法之一。泊洛沙姆作為一類表面活性劑，是含有兩個聚氧乙烯和一個聚氧丙烯的非離子型三嵌段共聚物。其中泊洛沙姆188(P188)被認為具有較高安全性，同時它也是一種膜密封劑。既往研究顯示，P188能與二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二棕櫚酰磷脂酰甘油特異性結合，促進受損細胞膜的愈合[7]；P188也能顯著減輕細胞膜孔擴大，抑制碘化丙啶內流[8]。目前，使用膜密封劑來減輕MIRI的相關研究較少。2017年3月～2019年1月，本研究觀察了P188對大鼠MIRI的干預作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 實驗動物：SPF級雄性SD大鼠15只，體質量(250±20)g，購自廣東省醫學實驗動物中心。細胞：新鮮SD大鼠尾靜脈血紅細胞。主要儀器：Logiq E9超聲影像系統、ALC-V9小動物呼吸機、BL-420生理記錄儀。主要試劑：戊巴比妥鈉、P188標準品、2,3,5-三苯四唑氯銨(TTC)、伊文思藍(EB)、大鼠超敏心肌肌鈣蛋白I(hs-cTnI)ELISA試劑盒、脫氧核苷酸轉移酶介導的三磷酸脫氧尿苷缺口末端標記(TUNEL)凋亡試劑盒。本實驗方案經華南理工大學實驗動物倫理委員會批準(倫理編號2018027)。

1.2 P188對大鼠MIRI的干預作用觀察

1.2.1 MIRI模型建立及P188干預 15只大鼠隨機分為假手術組(SHAM組)、生理鹽水組(NS組)和P188組，每組5只。SHAM組僅開胸不進行冠狀動脈左前降支結扎。在NS組和P188組大鼠左心耳下方2 mm水平處用6-0縫線暫時性結扎左前降支使心肌變白、心電圖Ⅱ導聯ST-T段抬高。缺血30 min后，P188組經尾靜脈注射15%的P188 250 mg/kg。NS組給予等量生理鹽水。隨后解開結扎處恢復灌注。以結扎水平下的心肌變白、心電圖ST-T段升高判定為MIRI模型制作成功。

1.2.2 心功能評價 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，進行超聲心動圖檢查。采用M模式，分別于結扎術前和再灌注2 h后記錄左心室縮短率(FS)和射血分數(EF)，計算術后與術前FS、EF的差值ΔFS、ΔEF。

1.2.3 心肌損傷標志物檢測 按ELISA試劑盒說明書操作，測定大鼠血漿hs-cTnI。

1.2.4 心肌組織觀察及梗死區與風險區面積比測定 維持麻醉，原位結扎大鼠心臟的左前降支。取大鼠動脈血3 mL置于肝素管中，左心室注射1.5%的EB 3 mL，靜置4 min。處死大鼠，取心臟速凍后切成5～6塊約2 mm厚的切片并將其浸泡于37 ℃的3% TTC中20 min。將心臟切片放入10%的中性甲醛溶液中固定15 min，拍照后用Image Pro Plus 6.0軟件分割圖像并計算梗死區與風險區面積比[9]。

1.2.5 心肌細胞凋亡率測算 將大鼠心臟切片，進行TUNEL染色，將切片脫蠟、修復、破膜后，加入末端脫氧核苷酸轉移酶和鳥苷三磷酸的混合物。孵育后，用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對細胞核進行復染后封片。DAPI染色的細胞核在紫外光的激發下呈藍色，凋亡細胞核呈綠色。在熒光顯微鏡下采集圖像。采用Image Pro Plus6.0軟件分析并計算免疫熒光圖像中的凋亡細胞數和總細胞數。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數。

1.3 P188的細胞膜保護作用觀察

1.3.1 細胞分組及給藥方法 將大鼠尾靜脈血紅細胞分為7組，分別與PBS、不同濃度(1.88%、3.75%、7.5%、15%)的P188溶液、1%曲拉通X-100(Triton-X 100，一種經典的快速裂解細胞組織的強破膜劑)溶液、含15% P188與1% Triton-X 100的混合溶液(即Triton+P188)共孵育。

1.3.2 相對細胞膜破裂率計算 各組紅細胞與200 μL對應溶液在37 ℃恒溫振蕩箱中共孵育2 h，震蕩速度75次/min。離心后在541 nm波長下測定上清液的光密度(OD)值，計算相對細胞膜破裂率。

1.3.3 細胞形態觀察 各組紅細胞孵育2 h或12 h后在倒置顯微鏡下觀察拍照，觀察細胞形態。正常紅細胞在光鏡下可表現出良好的折光性。

2 結果

2.1 P188對大鼠MIRI的干預作用

2.1.1 各組大鼠心功能比較 NS組與P188組干預后均發生不同程度的左心室運動減弱。NS組、SHAM組、P188組ΔFS分別為-15.2%±4.4%、-0.2%±0.8%、-5.4%±4.3%，ΔEF分別為-14.4%±4.7%、-0.2%±0.8%、-4.7%±3.9%。NS組ΔFS、ΔEF低于SHAM組(P均<0.05)，但P188組與NS組、SHAM組差異無統計學意義。見圖1。

圖1 各組大鼠超聲心動圖表現

2.1.2 各組大鼠心肌損傷標志物水平比較 NS組、SHAM組、P188組大鼠血漿hs-cTnI水平分別為(640.8±60.6)、(302.4±42.1)、(460.7±25.9)pg/mL，P188組、SHAM組血漿hs-cTnI水平均低于NS組(P均<0.05)。

2.1.3 各組大鼠心肌梗死區與風險區面積比比較 各組大鼠心肌組織切面見圖2。P188組、NS組、SHAM組梗死區與風險區面積比分別為0.12±0.03、0.43±0.08、0，P188組梗死區與風險區面積比低于NS組(P<0.05)。

圖2 各組大鼠心肌組織切面

2.1.4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較 NS組、SHAM組、P188組大鼠心肌細胞凋亡率分別為73.8%±5.9%、4.4%±1.6%、41.0%±7.1%，P188組、SHAM組心肌細胞凋亡率均低于NS組(P均<0.05)。

2.2 P188對紅細胞膜的保護作用

2.2.1 各組紅細胞相對細胞膜破裂率比較 15%及更低濃度的P188對細胞膜無明顯損傷。孵育2 h后，不含Triton的各組紅細胞基本未見破壞，Triton組紅細胞膜破壞最嚴重，Triton+P188組紅細胞膜破壞較輕。詳見圖3。PBS組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組相對細胞膜破裂率分別為0、-0.3±0.1、-0.3±0.0、3.4±0.0、11.2±0.8、100.0±0.0、6.5±0.1，孵育2 h后1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton+P188組相對細胞膜破裂率均低于Triton組(P均<0.05)。

注：A1～7分別為PSB組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組。

圖3 各組紅細胞膜破裂情況

2.2.2 各組紅細胞形態變化 孵育2 h后，不含Triton的各組均可見折光性好的完整細胞，Triton組未見完整細胞，Triton+P188組仍可見完整細胞。孵育12 h后，Triton+P188組中觀察不到完整的細胞，而PBS組仍能觀察到完整細胞。見圖4。

注：A1～7分別為PBS組、1.88% P188組、3.75% P188組、7.5% P188組、15% P188組、Triton組、Triton+P188組孵育2 h后細胞形態；A8、A9分別為Triton+P188組、PBS組孵育12 h后細胞形態。

圖4 各組紅細胞形態變化

3 討論

細胞膜損傷是MIRI的重要機制之一，既往研究顯示P188可以幫助骨骼肌細胞在氧化環境中保持完整性，也可以作為細胞保護劑被加入到細胞培養基[10]。既往研究采用15%、250 mg/kg的P188進行體內研究[11]，本研究在體內沿用該P188濃度，另于體外實驗中設不同濃度組進行探究。本研究結果顯示，P188組心肌組織梗死區與風險區面積比、心肌細胞凋亡率及血漿hs-cTnI水平均低于NS組，表明P188有助于減輕大鼠MIRI，降低了缺血心肌細胞在再灌注過程中轉向死亡的可能。正常情況下，大部分線粒體通透性轉化孔(mPTP)關閉。當線粒體鈣超載時，線粒體膜電位降低，mPTP打開，導致線粒體膜通透性增加，加速線粒體凋亡相關因子的釋放，導致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)依賴性和非Caspase依賴性細胞死亡。有研究表明，P188可降低Caspase-8、細胞色素C、Caspase-9的表達及凋亡執行因子Caspase-3的表達[12]。P188有可能通過調節凋亡相關因子的表達從而減輕MIRI[12,13]。不同于細胞凋亡率或梗死區與風險區面積比，左心室心肌運動功能只有在心肌細胞功能顯著改善時才會發生明顯改變。本研究中，NS組與P188組ΔFS、ΔEF差異無統計學意義，暫無充分證據表明P188有改善心功能的作用，這可能與樣本量、選用的方法或其他原因有關[11,14]。

為進一步探討P188的作用機制，本實驗還觀察了P188對大鼠紅細胞膜的保護作用。已知P188通過進入細胞膜破裂處的外圍部分來修復細胞膜,這種現象以往只在模擬的生物膜中觀察到[7,15]。我們的實驗在細胞水平證實了P188可以直接使細胞抵抗強破膜劑的短期破壞作用。這種膜密封特性可能與P188特定的理化參數有關，如臨界膠束濃度、親水親脂平衡、表面活性劑膜/水分配系數或填料參數等，尤其是臨界膠束濃度。本研究中，在P188中孵育的紅細胞與PBS組的紅細胞表現相似，表明P188作用溫和，對細胞膜不會產生顯著損傷，不會引起明顯的細胞死亡。破膜劑TritonX-100作用迅速，可在數秒內使幾乎所有的細胞膜發生破裂。P188的機械作用能夠使紅細胞在破膜劑孵育2 h后仍保持正常形態，這是由于P188的聚氧乙烯嵌段能投射到脂質雙分子層兩側的水道中，幫助修復膜屏障。然而，在含P188與Triton X-100的溶液中孵育12 h后，鏡下觀察未見完整紅細胞，則表明P188修復破裂的細胞膜的能力是有限的，P188不能維持發生持續損傷的細胞膜的完整性。當細胞膜產生的孔洞較小、直徑在0.2 μm以下時，細胞膜的脂質雙分子層的斷裂端可在自由能作用下再次融合，細胞膜因此修復。當細胞膜產生的孔洞較大時，需要激活細胞內源性的修復機制，胞內小囊在肌球蛋白與驅動蛋白的作用下轉移到細胞膜缺損處，進行細胞膜修復。當細胞膜破裂過大時，P188無法通過單純的機械作用來修復細胞膜，最終導致細胞膜損傷。

P188是一種可靜脈注射材料，具有高度的生物相容性，能防止被巨噬細胞攝取，待生物膜愈合后還可被“擠出”膜結構[16]。P188在眼組織、生殖系統和肝臟中應用具備一定的安全性。在體內，P188濃度較高的組織依次為腎臟、淋巴結、肝臟、脾臟、膀胱和胃腸道。在大鼠、狗和人體內，P188的清除幾乎完全是通過腎臟以原型排出[17～20]。我們發現，P188可導致大鼠腎近曲小管細胞輕度腫脹伴空泡變性，但未見明顯壞死征象。鑒于上述實驗結果，我們認為，盡管P188是眾多表面活性劑中安全性很高的一種，但濃度為15%、劑量為250 mg/kg的P188對大鼠腎臟仍有一定程度的損害。

綜上所述，P188可減少缺血再灌注損傷大鼠的心肌梗死面積及心肌細胞凋亡率、降低hs-cTnI水平，減輕心肌損傷；其對心功能無明顯改善作用，且對腎近曲小管細胞有一定損傷。P188減輕MIRI的機制與其細胞膜穩定作用有關，但P188不能逆轉持續破壞作用下導致的細胞膜破裂。