合并左心室肥厚對高血壓患者血清miRNA-455水平的影響及意義

吳春濤，劉蘇，李擁軍，唐閩，劉鈺，李倩

(河北醫科大學第二醫院，石家莊050000)

高血壓病嚴重危害人類生命和健康。血壓長期持續增高使心臟和血管結構發生改變，從而出現靶器官損傷及并發癥。高血壓病靶器官損傷主要表現之一為左心室肥厚，即心室重構，一旦出現容易引起心律失常和心力衰竭[1，2]。有效逆轉左心室肥厚和延緩心室重構是高血壓病治療的重點。左心室重構主要表現為心肌細胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌細胞(成肌纖維細胞)及非細胞成分(膠原纖維)增加、心肌電生理和代謝異常。早期的左心室重構以心肌細胞肥大為主，伴隨心肌細胞凋亡，結締組織增生(主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原)；后期因Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的增加，左心室順應性降低，心功能日趨惡化，心室舒張功能減退。我們前期實驗證實微小RNA455(miRNA-455)通過其靶基因鈣網蛋白(Calr)參與升主動脈縮窄后小鼠的心室重構[3]。本研究觀察了合并左心室肥厚的高血壓患者血清miRNA-455水平變化，分析其與心肌纖維化指標的相關性，以期為評估高血壓病情提供新的參考指標，也為高血壓的診斷治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2～12月于河北醫科大學第二醫院心血管內科確診、未經治療的原發性高血壓患者140例為研究對象，其中高血壓2級以上合并左心室肥厚者60例(病例組，男34例、女26例)，單純高血壓2級以上者80例(病例對照組，男42例、女38例)。排除有繼發性高血壓病、糖尿病和其他心血管疾病患者。另選取在本院進行健康體檢的正常人50例作為健康對照組，男27例、女23例。病例組、病例對照組與健康對照組的年齡、性別、有吸煙史者(分別為18、25、13例)、血糖、BMI和肌酐水平等資料差異無統計學意義。病例組、病例對照組的收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、左心室質量指數(LVMI)高于健康對照組，且病例組LVMI高于病例對照組(P均<0.01)。見表1。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

表1 三組一般資料比較

注：與健康對照組相比，**P<0.01；與病例對照組相比，##P<0.01。

1.2 miRNA-455檢測 抽取各組橈動脈血5 mL于含EDTA抗凝劑的采血管中，靜置1 h，室溫1 200 r/min離心15 min。提取上清液分裝到去RNA酶的EP管中，再以8 000 r/min充分離心5 min，取上層血漿每500 μL分裝至RNase-free EP管中，最終每例收集2～3管，然后放置到-80 ℃低溫冰箱中保存待用。將離心得到的血漿取500 μL到新的離心管中，按照試劑操作說明提取樣本總RNA，放置于-80 ℃低溫冰箱中保存。配制25 μL體系的逆轉錄反應液進行逆轉錄，得到cDNA。以RNU6B為內參，進行PCR反應，ABI 7500儀檢測miRNA-455的Ct值。以2-ΔCt作為目的miRNA的相對表達量。

1.3 血清心肌纖維化指標檢測 病例組和病例對照組于入院后次日晨(空腹12 h以上)仰臥休息30 min后、健康對照組于體檢當日抽取靜脈血3～4 mL，室溫下凝固，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測各組血清基質金屬蛋白酶9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)、Ⅰ型膠原氨基端肽(PⅠNP)和Ⅲ型膠原氨基端肽(PⅢNP)，按試劑盒說明進行操作。

2 結果

2.1 各組血清miRNA-455相對表達量比較 病例組、病例對照組、健康對照組血清miRNA-455相對表達量分別0.000 071±0.000 044、0.000 230±0.000 066、0.000 385±0.000 242，病例組和病例對照組血清miRNA-455相對表達量低于健康對照組，且病例組低于病例對照組(P均<0.05)。

2.2 各組血清心肌纖維化指標比較 病例組、病例對照組血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于健康對照組，且病例組PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于病例對照組(P均<0.05)。病例組、病例對照組MMP-9/TIMP-1低于健康對照組，且病例組MMP-9/TIMP-1低于病例對照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比較

注：與健康對照組相比，*P<0.05；與病例對照組相比，#P<0.05。

2.3 血清miRNA-455表達與心肌纖維化指標水平的相關性 將所有研究對象的血清miRNA-455表達水平與血清纖維化指標進行相關性分析發現，血清miRNA-455表達水平與血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈負相關(r分別為-0.759、-0.823、-0.630、-0.682，P均<0.05)。

3 討論

高血壓后心室重構主要表現為心肌細胞肥大和心肌細胞外基質(ECM)重構。早期的左心室重構主要以心肌細胞肥大為主，伴隨心肌細胞凋亡，這其實是心臟對壓力負荷增加的代償反應，可以降低升高的室壁張力，維持乃至增加射血分數。但隨著病變進行性發展到后期，凋亡的心肌細胞逐漸由ECM即心肌膠原代替，導致心功能惡化(如射血分數進行性降低等)。膠原(Ⅰ、Ⅲ型膠原為主)為ECM的主要成分，占85%左右[4]，主要由占心肌細胞總數2/3的心臟成纖維細胞合成。心肌纖維化早期Ⅲ型膠原mRNA表達、后期Ⅰ型膠原及前膠原蛋白mRNA增加等，導致Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加，出現左心室順應性下降，影響其舒張功能。在本研究中也可以看出，高血壓患者血清Ⅰ、Ⅲ型膠原增多，尤其是在高血壓合并心室肥厚的患者更為明顯。膠原基因的轉錄及各種基質金屬蛋白酶(MMPs)調節膠原的合成和降解。MMPs是一個內源性的鋅依賴性酶家族，通過降解ECM，使纖維膠原降解增加，導致ECM重構。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制劑。在心肌組織中MMPs與TIMPs之間存在嚴格的平衡，這種平衡一旦遭到破壞，即MMPs/TIMPs比例失調(下降)會導致心肌纖維化發生與進行性發展[5]。有研究顯示，雖然高血壓合并心肌肥厚組的血清MMP-9、TIMP-1水平高于非心肌肥厚組，但其血清NMP-9/TIMP-1比值低于非心肌肥厚組，提示膠原代謝異常在合并心肌肥厚組中更為突出。膠原合成增多，降解抑制進一步增強，促使體內膠原沉積進一步加重,從而促進心肌纖維化的發展[6]。本研究中，血清MMP-9、TIMP-1水平隨著心室肥厚的進展而明顯增加，MMP-9/TIMP-1比值下降。

miRNA作為重要的表觀遺傳調節分子，通過轉錄后負性調節目的蛋白表達從而參與許多心血管疾病的發病和進展，其中包括心肌肥厚和心肌纖維化。有報道miRNA-672通過降低其靶基因JUN延緩血管緊張素Ⅱ和胰島素樣生長因子1刺激的心肌細胞肥大[7]。miRNA-221/222家族包含轉化生長因子β(TGF-β)信號的幾個基因(包括JNK1、TGF-β1、TGF-β2、ETS-1)，進而參與壓力過負荷引起的心肌纖維化[8]。miRNA-195可通過下調與瓣膜鈣化相關的SMAD7表達，從而促進ECM的重塑[9]。近年來，miRNA-455在人類疾病發病中的作用逐漸受到重視，如在經常鍛煉的糖尿病小鼠體內miRNA-455表達上調，降低了加速纖維化的MMP-9的表達，從而減少了心血管并發癥[10]。TGF-β1導致miRNA-455在肺成纖維細胞中表達降低，進而影響慢性阻塞性肺疾病肺組織的修復[11]。在心肌成纖維細胞中，miRNA-455表達水平與血管緊張素Ⅱ誘導的Ⅰ、Ⅲ型膠原表達呈負相關；miRNA-455表達上調會減輕心肌纖維化[12]。

本課題組前期實驗發現，TAC心室重構的小鼠心肌中miRNA-455表達下調，而上調miRNA-455表達可使心肌膠原纖維明顯減少，心肌纖維化指標TGF-β1、結締組織生長因子(Ctgf)表達降低，抑制心肌纖維化進展。隨著基因檢測技術的發展，循環血檢測也可觀察miRNA表達變化，為臨床研究提供新的實驗室證據。研究發現，穩定型心絞痛和不穩定型心絞痛患者血漿miRNA-149、miRNA-424表達水平較健康對照者降低，而miRNA-765水平升高[13]；急性心肌梗死時，血清miRNA-1表達量高于正常對照組[14]。鑒于上述研究結果，本課題組試圖觀察高血壓合并心心室肥厚患者血清miRNA-455的表達變化，分析其與心肌纖維化的相關性。本研究結果顯示，病例組和病例對照組血清miRNA-455相對表達量低于健康對照組，且病例組低于病例對照組，表明高血壓患者血miRNA-455表達呈下降趨勢，在合并左心室肥厚者miRNA-455表達下降更明顯，這與前期小鼠實驗結果相一致。將所有研究對象的血清miRNA-455表達水平與血清纖維化指標進行相關性分析顯示，血清miRNA-455表達水平與血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈負相關，提示心肌纖維化越嚴重，血中miRNA-455表達下降越顯著。結合上述結果，我們推測miRNA-455水平可能有助于反映高血壓合并心室肥厚的嚴重程度及心肌纖維化程度;miRNA-455有可能成為心室肥厚和心肌纖維化新的生物標志物，檢測血miRNA-455水平有助于評估高血壓治療效果。