納米鉭種植體對兔脛骨修復(fù)部位微環(huán)境影響

郝春波 王周凱欣

種植體修復(fù)是口腔牙列的缺損與缺失重要的治療方法，如何提高種植體的成功率成了最為主要的問題，對患者種植體修復(fù)能夠成功起到了決定性的作用[1]。種植體與牙槽之間通過骨合作用形成牢固結(jié)合，種植體表面的化學(xué)修飾對整個骨結(jié)合的過程具有實(shí)質(zhì)上的影響，通過改變表面的化學(xué)成分，金屬材料會具備更加高的生物活性，從而有效地促進(jìn)與骨組織之間的愈合狀態(tài)[2]。鈦種植體是目前最常采用的一類種植體，在臨床獲得廣泛的應(yīng)用[3]。但隨著口腔醫(yī)學(xué)的發(fā)展，鈦種植體的許多問題得以暴露，如何進(jìn)行骨的誘導(dǎo)效應(yīng)以及生物活性亦或是尋找更加有效的金屬種植體更了醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[4]。研究顯示鉭金屬與機(jī)體有非常好的生物相容性，可以和成骨細(xì)胞發(fā)生一定的結(jié)合反應(yīng)，且不會引起機(jī)體發(fā)生中毒等不良反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)將比較了納米鉭種植體與純鈦種植體在植入兔脛骨后對修復(fù)部位微環(huán)境的影響，力求為納米鉭種植體在人體內(nèi)的成骨結(jié)合作用提供微環(huán)境融合方面的借鑒。

1 材料與方法

1.1 動物

30 只5 月齡新西蘭大白兔，均為雄性，2～3 kg，常規(guī)喂養(yǎng)，隨機(jī)分為純鈦種植體組與納米鉭種植體組，每組15 只。

1.2 試劑與材料

單面刀片、蠟鏟、臺木、切片機(jī)、切片刀、毛筆、蠟帶盤、水浴鍋、染色缸、載玻片(Beyotime公司)；蘇木素染液(Leagen公司)；PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀7500型(ABI公司，美國)；0.25%胰蛋白酶消化液、青霉素、鏈霉素(Gibco公司，美國)；RNeasy Mini Kit(QIAGEN公司，德國)；TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMan快速通用PCR反應(yīng)液(Applied Biosystems公司，美國)；4%戊巴比妥溶液(SIGMA公司，美國)及由生工生物工程上海股份有限公司合成引物(表 1)。

表 1 引物名稱及序列

1.3 方法

1.3.1 脛骨種植體植入[6]5 月齡雄性新西蘭大白兔30 只，隨機(jī)分為純鈦種植體組與納米鉭種植體組(n=15)。耳緣靜脈注射30 mg/kg戊巴比妥鈉全麻下，在雙側(cè)脛骨近心端離脛骨頭(0.5～1.0 mm)骨嵴內(nèi)側(cè)骨面，以球鉆定位，先鋒鉆裂鉆制備出寬3.3 mm深度為8.0 mm的洞形。將純鈦種植體與納米鉭種植體擰入骨組織，末端平齊骨緣，分層嚴(yán)密縫合，術(shù)后抗炎3 d，進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3.2 種植體周圍組織學(xué)取材 術(shù)后每組在1、4和8 周各處死2 只新西蘭大白兔，注射過量4%戊巴比妥，在種植體周圍環(huán)形切取軟組織，儲存于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.3 形態(tài)學(xué)切片制作和觀察 4%多聚甲醛固定新西蘭白兔種植周圍組織標(biāo)本，常規(guī)制片，蘇木精、伊紅染色。中性樹膠封后于顯微鏡下觀察。

1.3.4 熒光定量PCR檢測 取術(shù)后1 周時(shí)處死的大白兔的種植體周圍軟組織，采用RNeasy Mini Kit提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)條件為：25 ℃ 30 min→42 ℃ 30 min→85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，采用2×TaqMan快速通用PCR反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量檢測PCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min→(95 ℃ 30 s→64.5 ℃ 45 s→72 ℃ 1 min)×40 個循環(huán)，4 ℃保溫，于62 ℃時(shí)采集熒光信號。以GAPDH作為參比，計(jì)算TNF-α、IL-6與IL-1β mRNA表達(dá)水平，相對含量=2-△△Ct，其中△△Ct=△Ct樣本目的基因-△Ct樣本GAPDH。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后種植體周圍組織形態(tài)變化分析

本研究2 組新西蘭大白兔均存活，且種植體周圍骨組織與種植體接觸界面上有著較好的整合；通過對2 種種植體術(shù)后1、4、8 周的組織學(xué)觀察，可以發(fā)現(xiàn)2 組在術(shù)后1 周均有較多的中性粒細(xì)胞浸潤，相對于純鈦種植體組的生長變化，納米鉭種植體組在4 周后有較多的新骨層，到第8周，能看到更大面積的基質(zhì)骨的形成；HE切片染色顯示圖顯示納米鉭種植體組具有更好的成骨細(xì)胞生長性，種植體與周圍組織形態(tài)的切合率更高(圖 1)。

2.2 種植體周圍軟組織TNF-α、IL-6與IL-1β mRNA表達(dá)情況分析

納米鉭種植體組種植體周圍軟組織中促炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)水平均顯著高于純鈦種植體組(P<0.05)，2 組IL-6的mRNA表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖 2)。

3 討 論

鉭材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中逐漸表現(xiàn)出良好和廣泛應(yīng)用性，大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)鉭植入人體后不會造成損傷，肌肉組織切片在鉭材料上有著良好的生長分裂，充分證實(shí)鉭金屬與機(jī)體有非常好的生物相容性[7]。因此自從上個世紀(jì)40年代開始這種金屬逐漸在醫(yī)學(xué)各專業(yè)上得到了很好的推廣與應(yīng)用，從心臟起搏器、修復(fù)神經(jīng)的金屬絲、骨頭缺損的修復(fù)方面均能看到它發(fā)揮作用的身影，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到關(guān)注[8]。這都為鉭作為口腔醫(yī)學(xué)種植體的應(yīng)用做了很好的鋪墊研究。目前尚缺少納米鉭金屬種植體植入后修復(fù)部位炎癥反應(yīng)和微環(huán)境變化的研究報(bào)道，本研究將納米鉭金屬種植體與傳統(tǒng)使用的純種鈦種植體進(jìn)行了對比，力求為納米鉭種植體在人體內(nèi)的成骨結(jié)合作用提供微環(huán)境融合方面的借鑒。

圖 1 2 組種植體術(shù)后種植體周圍組織形態(tài)學(xué)改變 (HE)

Fig 1 Morphological changes of the microenvironment around implants in the 2 groups (HE)

圖 2 術(shù)后1 周2 組種植體周圍軟組織炎性因子mRNA水平比較

Fig 2 Comparison of mRNA levels of inflammatory factors in soft tissue around the implants between the 2 groups 1 week postoperation

本研究結(jié)果顯示2 組材料種植體周圍骨組織與種植體接觸界面上均有著較好的整合，通過對2 種種植體術(shù)后1、4、8 周的組織學(xué)觀察，可以發(fā)現(xiàn)2 組在術(shù)后1 周均有較多的中性粒細(xì)胞浸潤，相對于純鈦種植體組的生長變化，納米鉭種植體組在4 周后有較多的新骨層，到第8周，能看到更大面積的基質(zhì)骨的形成；HE切片染色顯示圖顯示納米鉭種植體組具有更好的成骨細(xì)胞生長性，種植體與周圍組織形態(tài)的切合率更高。提示納米鉭種植體在一定的培養(yǎng)時(shí)期后，出現(xiàn)新的骨層以及更大面積基質(zhì)骨的幾率更大，初步證明了納米鉭種植體在口腔種植體中較鈦金屬的優(yōu)勢所在。

本研究通過對2 種種植體周圍軟組織術(shù)后1 周后的TNF-α、IL-6 與IL-1β mRNA 的表達(dá)水平比較，發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α、IL-1β在純鈦種植體組的表達(dá)水平顯著高于納米鉭種植體組要高出許多，兩組IL-6表達(dá)水平無顯著差異，提示納米鉭種植體組的種植體術(shù)后炎癥反應(yīng)較純鈦種植體組低，顯示納米鉭種植體術(shù)后發(fā)生種植體周圍炎風(fēng)險(xiǎn)更低，充分說明了納米鉭種植體與周圍的骨組織具有較好的融合性，成骨細(xì)胞的排斥性更低，側(cè)面證實(shí)后后期骨結(jié)合效率的有效提高性。種植體周圍組織中一旦發(fā)生炎癥，這些炎癥能夠迅速地從周圍組織向結(jié)締組織甚至骨組織中發(fā)展，而在牙周組織中的發(fā)展要明顯慢得多[9-10]。

綜上，納米鉭種植體組的種植體術(shù)后炎癥反應(yīng)較純鈦種植體組低，從而推測納米鉭種植體術(shù)后發(fā)生種植體周圍炎風(fēng)險(xiǎn)更低。