東北地區狐源大腸桿菌磺胺類耐藥基因的檢測與分析

鞠明霖 柴 榮 馮子軒 張 喆 薛 原

(東北林業大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

中國的狐類動物養殖產業已有較長的歷史，目前還在不斷地發展之中，由于氣候、籠舍建設、環境條件以及預防衛生措施等問題，狐大腸桿菌引起的疾病發生頻繁，對狐類動物的養殖有極大影響。因大腸桿菌(Escherichiacoli)能遺傳抗生素的耐藥基因[1]，其耐藥基因的研究更成為人們關注的熱點。國內外關于禽源、豬源、牛源等食品動物源大腸桿菌耐藥基因檢測的研究較多，而對于狐類動物的大腸桿菌耐藥基因的研究報道很少。

磺胺類藥物在抗細菌、抗真菌、抗癌、抗寄生蟲、消炎鎮痛、抗病毒、抗驚厥等多個醫藥領域顯示巨大開發價值[2]。在前期已對大腸桿菌進行藥物敏感性檢測的基礎上，本研究隨機采集了涵蓋黑龍江、吉林、遼寧三省多個狐養殖場的156株樣本，針對狐源大腸桿菌對磺胺類藥物的耐藥基因進行檢測和分析，了解東北地區狐源大腸桿菌對磺胺類藥物的耐藥情況，為實現狐類養殖中科學合理用藥、有效防治疾病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從黑龍江、吉林、遼寧部分狐養殖場采集樣本，并運回實驗室進行細菌分離培養，經分離鑒定，共有156株大腸桿菌。

1.1.2 儀器

PCR儀德國Biometra公司產品、凝膠成像分析系統美國Alpha Imager 2200公司產品。

1.1.3 試劑

Buffer、dNTP、rTaq、DNA Maker、TaqMix等購于寶生物有限公司。

1.1.4 引物合成

參照Sunde和Norstr?m[3]合成sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ磺胺類耐藥基因的引物。

1.2 方法

1.2.1 耐藥基因的PCR擴增

PCR反應體系：取156株樣品進行體系配置。25 μL反應體系配置如下：Buffer加入2.5 μL，dNTP加入2.0 μL，上游、下游兩條引物各加入0.5 μL，去離子水加入18 μL，rTaq加入0.25 μL，樣品DNA模板加入2 μL。將體系搖勻后放入PCR儀器中進行擴增。

PCR反應過程：95℃下進行預變性5 min，94℃開始變性1 min，退火45℃ 1 min，72℃下延伸1 min，循環35次，最后一次72℃下延伸5 min，4℃預冷3 min。

1.2.2 PCR產物的檢測

將PCR擴增產物放入1%瓊脂糖培養基中進行電泳，使用GoldVlewⅠ型核酸染色劑進行染色，將電泳結果放在凝膠成像分析系統中觀察，并將實驗結果拍攝。

2 結果與分析

2.1 PCR產物電泳結果

以狐源大腸桿菌的DNA為模板進行PCR擴增，得到的sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳，獲得預期長度的電泳條帶，部分結果見圖1，圖2，圖3。

圖1 耐藥基因sulⅠPCR產物電泳結果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐藥基因Fig.1 Electrophoresis results of sulⅠ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance genes of some strains

圖2 耐藥基因sulⅡPCR產物電泳結果M.Marker 2000；1—5.部分菌株耐藥基因Fig.2 Electrophoresis results of sulⅡ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-5.Drug resistance genes of some strains

圖3 耐藥基因sulⅢPCR產物電泳結果M.Marker 2000；1—6.部分菌株耐藥基因Fig.3 Electrophoresis results of sul Ⅲ PCR products of drug resistance geneM.Marker 2000.1-6.Drug resistance

2.2 磺胺類耐藥基因檢測結果與分析

狐源大腸桿菌的樣本共有156株，經PCR擴增和產物的檢測，得出檢測結果見表1。其中156株樣本中磺胺類藥物的耐藥性耐藥基因sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ均有測出，分別為19.23%(30/156)、44.87%(70/156)、20.51%(32/156)。此結果還具有明顯的地域差異：在黑龍江的93株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為25.81%(24/93)、45.16%(42/93)、29.03%(27/93)，在吉林的24株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為16.67%(4/24)、91.67%(22/24)、8.33%(2/24)，在遼寧的39株樣本中sulⅠ、sulⅡ和sulⅢ的檢出率分別為5.13%(2/39)、15.38%(6/39)、7.69%(3/39)。

表1 156株狐源大腸桿菌磺胺類耐藥性統計Tab.1 Statistics of sulfonamide resistance of 156 strains of fox-derived Escherichia coli

3 討論

大腸桿菌是一類普遍存在于自然界，并能引發人和動物共同感染的輕微或嚴重的人畜共患病病原。根據養殖場的衛生條件、管理水平、用藥習慣，養殖動物的患病情況也各不相同，如成年母畜感染大腸桿菌常引起流產和死胎，給養殖業帶來較大經濟損失[4]。

磺胺類藥物具備抗菌譜廣、價錢低廉、化學性質穩定、應用便利等長處，能抑制大多數革蘭氏陽性菌和某些陰性菌，是常用的抗菌藥物，也是廣泛使用的抗生素。其抗菌機理是干擾細菌的葉酸代謝，使細菌的生長、繁殖受到抑制。磺胺類藥物常用來預防和治療狐類等毛皮動物的部分疾病，但如果被長期或過量等不當使用，則會導致耐藥菌的產生或其耐藥能力的增強，從而減弱磺胺類藥物的藥效，影響疾病防治效果，甚至對養殖造成不可估量經濟損失。此外，磺胺類藥物在水體中的殘留可對公共健康構成潛在威脅[5]。

根據磺胺類藥物耐藥基因的檢測結果可見，黑龍江地區的狐類對磺胺類的藥品耐藥性總體上要略高于其他兩個地區，已經呈現出較嚴重的耐藥性。但其檢出率仍低于其他地區的牛[6]、兔[7]、禽類[8]等養殖動物。由相對較低的檢出率可推測出在東北地區狐類毛皮動物的養殖過程中對磺胺類藥物的投喂時間較短或藥量較少。目前東北是中國狐類毛皮動物養殖的主要地區，但將狐類作為經濟動物進行規模化養殖時間相較禽類、豬、牛等短，只有近幾十年的歷史，這可能是本次實驗檢出率低于其他動物的主要原因。我們可以通過聯合用藥、加強飼養管理、保證用藥的療程與藥量、嘗試使用新型獸藥等途徑，盡可能減少飼養動物對某一藥物的耐藥性。從東北地區養殖狐貍分離得到的大腸桿菌為對象，對其磺胺類藥物的耐藥基因進行了檢測分析，該結果可為狐類養殖過程中臨床合理用藥提供有力的參考依據。