黑鸛微衛(wèi)星位點的篩選及遺傳特點分析

仲光啟 由玉巖 徐艷春，3，4 劉學鋒 賈 婷金繼英 郭愛霞 張麗霞 楊淑慧*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040；2.北京動物園圈養(yǎng)野生動物技術北京市重點實驗室，北京，100044；3.國家林業(yè)與草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040；4.國家林業(yè)和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；5.保定市動物園管理處，保定，071000；6.濟南動物園管理處，濟南，250031；7.太原動物園，太原，030009)

黑鸛(Ciconianigra)屬鸛形目(Ciconiiformes)鸛科(Ciconiidae)鸛屬，無亞種分化，是一種體態(tài)優(yōu)美、分布廣泛、性情機警的大型涉禽，亞歐非均有其分布記載[1-4]。但黑鸛對棲息地環(huán)境，特別是覓食生境的要求極為苛刻，且食性較為單一[1，5]。因受氣候變化、棲息地破壞、人類活動等影響，黑鸛的種群數(shù)量急速下降。據(jù)2006年羅祖奎等的研究，全國野外的種群數(shù)量在1 000只左右[6]。目前黑鸛已被列入《中國瀕危動物紅皮書·鳥類》和《華盛頓公約·附錄II》[2]，因此，黑鸛的保護十分迫切。

國內外圍繞黑鸛的研究已經(jīng)積累了一些資料，主要圍繞繁殖生態(tài)[7-11]、人工飼養(yǎng)技術[12-15]、性別鑒定[16-20]、疾病救護[21]、食性[5，22-23]、遷徙[24-27]、行為及越冬[28-31]等，為黑鸛的保護提供了基本依據(jù)。人工飼養(yǎng)繁育是瀕危物種保護的重要手段，也是野化放歸的基本前提。目前，在中國的動物園中飼養(yǎng)黑鸛的數(shù)量約150只，主要集中在保定動物園、石家莊動物園、太原動物園等。在過去20年中，黑鸛的飼養(yǎng)繁育技術不斷取得突破，種群已經(jīng)進入平穩(wěn)增長階段。

然而，隨著種群的增長，種群管理的重要性逐漸凸顯出來。2011年中國動物園協(xié)會物種保護委員會專門成立黑鸛保護委員會，并建立了黑鸛的譜系簿。根據(jù)譜系記錄，目前種群建群者22只，潛在建立者38只。種群發(fā)展早期因為專注于繁殖成功率，園際種源調配開展的較少，各個動物園的種群總體上呈現(xiàn)相互隔離、近交的狀態(tài)。到2017年底，近交系數(shù)平均0.034 4，建群者遺傳多樣性保存量為19.36。按照目前的種群狀況，基因多樣性保持在90%以上，僅能維持13年。因此，當前最為迫切的是解決遺傳管理問題，以保持種群的質量和遺傳多樣性。

當前種群的遺傳管理需要解決如下幾個問題：第一，譜系的確證和勘誤。當前的譜系是根據(jù)動物園中原始記錄整理而成，而人工記錄難免有疏失、遺漏甚至錯誤。這類原始資料的錯誤是無法矯正的。因此，需要建立一些新的方法來矯正這些錯誤，并在后續(xù)的譜系續(xù)寫中確保信息正確。第二，建群者之間的實際關系在當時是不清楚的，因此作為無關個體對待。這樣，譜系本所有的遺傳統(tǒng)計都有可能存在偏倚，影響管理決策。第三，黑鸛體色不太豐富，個體識別信息較少，從出生到長成的變化往往影響對個體的準確識別，形成譜系的錯誤來源。第四，群體遺傳學統(tǒng)計中，基于譜系本的統(tǒng)計僅是表觀統(tǒng)計值，受信息誤差的影響大，需要更加精準的分析工具和統(tǒng)計方法來支持精準管理。

基于DNA的分子遺傳學分析能夠提供更為精準的遺傳信息，是精準管理的重要工具。微衛(wèi)星(microsatellites)是基因組上短串聯(lián)重復序列，因重復次數(shù)不同而呈現(xiàn)出高度多態(tài)性，因其突變率高、分布廣泛且均勻、多態(tài)性高、共顯性標記、選擇中性、易檢測、分型重復性好、取樣范圍大、統(tǒng)計方法多樣等優(yōu)點，在群體遺傳研究、親緣鑒定等方面得到了廣泛的應用，涵蓋了水產(chǎn)、家禽家畜、糧食作物、實驗動物、稀有物種、昆蟲等各個研究領域[32-36]。

傳統(tǒng)的微衛(wèi)星多態(tài)性分析依靠PCR技術。但是，作為引物區(qū)的微衛(wèi)星側翼序列在不同的物種之間有可能相同，也可能不同。因此，同一個微衛(wèi)星位點有時表現(xiàn)出近緣物種間的通用性，有時也表現(xiàn)出物種的特異性。根據(jù)這一特點，從近緣物種的微衛(wèi)星中能夠篩選到目標物種的微衛(wèi)星[35-36]。相比構建文庫從頭篩選，這是一種低成本的策略。

目前為止，尚未有黑鸛微衛(wèi)星的報道，為了解決黑鸛人工飼養(yǎng)種群的上述管理問題，本研究通過對黑鸛近緣物種微衛(wèi)星位點中篩選了適合于黑鸛的位點，并針對我國當前黑鸛人工飼養(yǎng)種群進行了群體遺傳特征的分析，探究其在黑鸛種群中的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣品及總DNA提取

在北京動物園的協(xié)助下，從保定動物園和太原動物園共采集了72只黑鸛個體。在2017年11月對黑鸛進行疫苗注射的同時，在翅下靜脈取靜脈血約0.5 mL，置于1.5 mL離心管中，以EDTA-Na2抗凝(終濃度1.5 mg/mL)，放在冰盒中預存。血液樣品運到實驗室后，每個樣品取5滴(約100 μL)均勻滴在DNA血樣采集卡上，避光靜置，干燥后置于陰涼處保存?zhèn)溆谩２捎肁xyPrep基因組DNA小量試劑盒(Axygen，抗州)提取總DNA。用NanoPhotometer-N50紫外分光光度計(Implen，Germany)測定DNA濃度，統(tǒng)一稀釋至10 ng/μL左右，4℃存放備用。

1.2 PCR擴增

本研究采用近緣物種交叉擴增的方法獲得黑鸛微衛(wèi)星。根據(jù)GenBank中已報道的微衛(wèi)星位點，結合黃赟[37]、張偉[36]、Wang[38]、Shephard[39]、Tomasulo-seccomandi[40]等人的文獻，選取白鸛(Ciconiaciconia)、東方白鸛(Ciconiaboyciana)、林鸛(Mycteriaamericana)和大藍鷺(Ardeaherodias)4個物種中，擴增效果較好的29個微衛(wèi)星共30對引物(表1)，以黑鸛DNA為模板進行擴增。在所有位點的上游引物5′端均加入一段M13序列(5′-GGAAACAGCTATGACCAT-3′)[41]，同時，單獨合成M13接頭序列并加上Fam熒光標記。所有引物及接頭序列均由哈爾濱擎科生物公司(TSINGKE)合成。PCR擴增采用北京全式金公司(TransGen Biotech)生產(chǎn)的TransStart TopTaq DNA Polymerase，擴增采用15 μL體系(表2)。所有位點的PCR擴增程序為：94℃/4 min，(94℃/30 s，Ta/40 s，72℃/30 s)×30 cycles，72℃/5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增效果PCR產(chǎn)物用ABI3100型遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測。

1.3 基因分型

毛細管電泳得到的是微衛(wèi)星等位基因擴增片段的觀測值[42]，利用毛細管電泳的這一特性，對各個微衛(wèi)星位點進行初步分型。毛細管電泳檢測的結果用GeneMapper軟件讀取，獲得毛細管電泳的峰圖和每個信號峰的片段長度。按照來源物種重復單元的提示信息，將片段長度轉換為等位基因。等位基因數(shù)據(jù)輸入Excel表格后，導入Cervus 3.0中，分析各個位點的等位基因數(shù)(NA)、觀測雜合(Ho)度、期望雜合度(He)和多態(tài)信息量(PIC)等信息。

2 結果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，共18個位點有明確的符合微衛(wèi)星片段大小的擴增產(chǎn)物，占篩選位點總數(shù)的60%。其余位點或是難以出現(xiàn)清晰條帶，或是雜帶過多而影響后續(xù)的毛細管電泳結果分析，亦或是擴增條帶過大(>500 bp)，難以判斷是否為微衛(wèi)星產(chǎn)物。

毛細管電泳顯示，在上述18個位點中，Cc01位點的峰值過低，干擾峰過多，無法對其基因型進行準確的判斷，故舍棄。其余位點均有明確的，符合預期的等位基因擴增產(chǎn)物，但是，Cc05、Cc06、WSμ13、WSμ14、Cbo102、Cbo121、Cbo133、Cbo151、Cbo168和Ah208都只有一個等位基因。其余7個位點Cc02、Cc03、Cc04、Cc07、Cc10、Cc37和Cc42有2—8個等位基因，占可擴增位點的35.3%(表1)。

Cc03、Cc37和 Cc42各發(fā)現(xiàn)2個等位基因，多態(tài)信息含量(PIC)僅有0.211—0.375，在群體分析中所能提供的遺傳信息較少。Cc02有4個等位基因，PIC為0.497，He為0.561，可以提供較多的遺傳信息。Cc04、Cc07、Cc10 3個位點的等位基因數(shù)(NA)在7—8個，PIC分別為0.518、0.731和0.784。在當前群體中，Cc02、Cc04、Cc07、Cc10都符合H-W平衡(P=0.088—0.601)，說明等位基因頻率分布比較符合隨機交配，為群體遺傳學指標的計算提供更多、更可靠的信息。

表1 微衛(wèi)星位點信息Tab.1 Information of microsatellites selected for cross amplification in the black stork Ciconia nigra

續(xù)表1

注：“*”表示重復單元之間含有一個堿基；“+”表示兩個重復單元之間存在幾個隨機堿基；a和b表示同一個位點的不同引物；PIC一列中，“()”中的數(shù)字表示等位基因個數(shù)；“—”表示數(shù)據(jù)未知；未標明出處位點的均來自GenBack
Note：“*” stands for repeating motif interrupted by a single nucleotide.“+” stands for repeating motif interrupted by several random nucleotides.“a” and “b” stand for one locus has different primers.In thePICcolumn，the figures in “()” stands for allele.“—” stands for the date unknown.the locus that are not marked are from GenBack

表2 微衛(wèi)星PCR擴增體系Tab.2 Components of PCR system of microsatellites

3 討論

微衛(wèi)星的側翼序列具有保守性，這是近緣物種間微衛(wèi)星位點交叉擴增的基礎。鳥類研究中，采用近緣種交叉擴增來篩選和使用微衛(wèi)星在雞形目(Galliformes)和雀形目(Passeriformes)比較集中[37]。特別是雞形目，得益于家雞的全基因組序列的成功測序和注釋，有超過900個微衛(wèi)星位點被發(fā)現(xiàn)和分析[35]，為雞形目其他物種的微衛(wèi)星交叉測試和遺傳管理應用提供了極大地便利。然而，鸛形目鳥類的基因組始終沒有測定，報道的微衛(wèi)星主要是通過建庫和探針篩選獲得的，總體數(shù)量非常有限，因此，對于黑鸛可借用的位點數(shù)就更少了。

本文從白鸛、東方白鸛、林鸛、大藍鷺4個物種中，選擇多態(tài)性好、擴增效果穩(wěn)定的29個微衛(wèi)星位點，測試在黑鸛的可用性。結果顯示，同屬的物種，微衛(wèi)星擴增成功率和多態(tài)性均高于關系較遠的物種。比較表1和表3可知，白鸛微衛(wèi)星有69.2%(9/13)能夠在黑鸛成功擴增，53.8%表現(xiàn)出多態(tài)性(NA≥2)，同屬的東方白鸛的微衛(wèi)星有71.4%(5/7)能夠在黑鸛成功擴增，但無一具有多態(tài)性。在林鸛和大藍鷺這兩個系統(tǒng)關系較遠的物種，微衛(wèi)星在黑鸛成功擴增率分別為33.3%和25.0%，但成功擴增位點均無多態(tài)性。

這表明一種趨勢，近緣種基因組序列相似度高，微衛(wèi)星成功交叉擴增的概率高，而遠緣種之間情況則相反。但是交叉擴增成功率與多態(tài)性沒有必然的聯(lián)系，而是取決于不同物種進化歷史的相似性。微衛(wèi)星是基因組上非常活躍的組件，所發(fā)生的進化事件會靈敏的反應在多態(tài)性上，不同物種經(jīng)歷的進化事件不同，同一個位點，即使側翼序列沒有變化，但多態(tài)性上會有顯著不同。這就為采用交叉擴增來獲得微衛(wèi)星位點構成風險。

盡管如此，本研究還是篩選到4個可用的黑鸛微衛(wèi)星位點，分別是Cc02、Cc04、Cc07、Cc10，這些位點擴增效果穩(wěn)定，多態(tài)信息含量高，等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡，可作為黑鸛群體遺傳學分析和遺傳管理之用。

表3 17個微衛(wèi)星位點在人工飼養(yǎng)黑鸛種群中的遺傳特點*Tab.3 Characteristics of 17 microsatellites in the captive black stork Ciconia nigra population*

續(xù)表3

*注：Cc01位點的峰值過低，干擾峰過多，無法準確分型，故舍棄
*Note：Cc01 was discarded due to low target signals and complex untargeted signals that risk genotyping