山東省某地鸚鵡喙羽病病毒的全基因組序列及對SPF雞胚的致病性探究

吳少鵬 宋 艷 孫淑紅

(山東農業大學動物科技學院，泰安，271000)

PBFD是一種在世界范圍內的鸚鵡鳥類中常見的、慢性的、最終致死鸚鵡的病毒病[1]。到目前為止，已經在地球上超過60種鸚鵡鳥中發現了PBFDV[2]，占到鸚鵡類物種的10%以上[3]。尤其對瀕危物種構成了巨大威脅[4]。PBFDV可以追溯到白堊紀澳大利亞古老的Psittacopasserine圓環病毒[5-6]，屬圓環病毒科(Circoviridae)的圓環病毒屬(Circovirus)。形態學上，14—16 nm，無包膜的二十面體形病毒，含有一個2 000 bp[7]的單鏈環狀ssDNA基因組，其中包括兩個相反方向的主要開放閱讀框(ORFs)，一個編碼衣殼蛋白(CP)，另一個編碼復制相關蛋白(REP)[8]。由于圓環病毒的物理化學特性，該病毒在體外環境中非常穩定，能夠防御惡劣和干燥的環境，高溫和化學攻擊[9]。盡管它可能是感染脊椎動物的最簡單的病原體，但它被認為是慢性病患者免疫抑制的原因[10]。受感染的鸚鵡很容易被細菌、真菌和病毒繼發感染[11]。感染PBFDV的大多數鸚鵡表現出異常形狀的喙、羽毛脫落[12]，羽毛萎縮，抑郁，營養不良[10，13]和皮膚表面寄生蟲的存在。它可以引起白細胞凋亡，并對法氏囊造成損傷，脾臟、胸腺和肝臟腫大，并可以觀察到肺和胸腺，上皮和心內膜組織的出血[14]。最常見的病理變化是淋巴器官中T淋巴細胞的迅速減少，如胸腺、脾臟和法氏囊[14]。它能通過在受感染的父母[15]通過卵或喂養期間[16]垂直傳播，通過羽毛粉塵、糞便和碎片在水平方向上進行傳播，但水平傳播更為嚴重[17]。然而，還未有商業化疫苗用于生產過程，并且未能在任何細胞或培養物中繁殖PBFDV[18]。一般來說，由于感染的流行和病毒的穩定性，治愈疾病的可能性不大，因此，鸚鵡病通常接受姑息治療和支持治療[19]。早期識別PBFDV感染對于降低鸚鵡死亡率和經濟損失具有重要意義[20]。

1 材料和方法

1.1 道德聲明

根據鸚鵡主人的意愿，批準了對動物進行的所有處理。

1.2 患病鸚鵡臨床情況

共收集了3只非洲灰鸚鵡(Psittacuserithacus)進行下一步試驗。我們觀察了鸚鵡的整體健康狀況，并調查了鸚鵡的喂養和管理情況。檢查鳥的形態特征和組織器官的變化，采集新鮮皮膚組織進行組織病理學分析，新鮮的肝臟和羽毛樣品用于DNA提取。

1.3 主要試劑

DNA Marker DL2000、pMD19-T克隆載體、Tris平衡酚購自TaKaRa。 TARANS 5α購自Biotech，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自OMEGA，PCRTaq酶購自康為世紀。瓊脂糖，氨芐西林，蛋白酶K購自Amresco。LB培養基購自Invitrogen，50×TAE購自索萊寶。無機試劑，如PBS，無水乙醇和氯仿，均由國內生產，分析純。

1.4 引物合成

根據GenBank上公布的標準序列，為PBFDV全基因組設計引物，估計的片段大小為約2 000 bp。由鉑尚公司合成，序列如下：

PBFDV-F：ATGGGCGGGGCTTGCATAACCTCT

PBFDV-R：GCCTGACGTAGATATCCGGGAACTCTCGC

1.5 DNA組織的提取

取出儲存在冰盒中的新鮮肝臟和羽毛組織，然后提取DNA[21]。

1.6 PCR程序

使用設計的引物PBFDV-F和PBFDV-R進行PCR程序。2 μL DNA模板，將含有2.5 μL 10 × mix緩沖液，2 μL dNTP，0.5 μL各引物和0.2 μL 1UTaq酶的PCR混合物加入雙蒸水至23 μL。PCR反應條件如下優化：95℃，5 min；94°C，45 s；59℃，45 s；72℃，1 min。35個循環，最后72℃，10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳收集預期長度的PCR產物，并且將該片段用凝膠回收試劑盒回收，并在-20℃保存。

1.7 重組質粒的構建和測序

根據pMD19-T載體說明書，我們將膠回收產品與載體連接并轉化，涂抹在含有氨芐西林的平板并在37℃下培養。將單菌落接種在LB液體培養基中，并用菌液作為樣品進行PCR。在陽性樣品中提取DNA后對質粒進行測序。

1.8 組織病理學分析

通過常規組織學方法處理福爾馬林固定的新鮮皮膚，將收集的新鮮皮膚組織置于4%多聚甲醛溶液中(厚度一般小于0.5 cm)，48 h后固定沖洗，將切片從低濃度移至高濃度酒精中，然后置于二甲苯中。接下來，將樣品置于熔化的顆粒石蠟中包埋并冷卻，將它們切成4—5 μm厚的切片，將切片熔化并附著到處理過的載玻片上，然后干燥，HE染色。使用Olympus BX顯微鏡和相機進行成像。

1.9 序列分析

將獲得的基因序列與GenBank相應片段序列中的其他公開的PBFDV進行比較，并通過DNAstar軟件進行分析。

1.10 PBFDV對SPF雞胚的致病性

如前所述，迄今為止，我們沒有發現適合PBFDV繁殖的細胞或其他培養物。我們大膽地假設是否可以使用SPF雞胚來復制病毒。取適量通過PCR鑒定陽性的羽毛囊置于ep管中充分剪至糊狀，加入0.5 mL滅菌PBS混勻，置于-80 ℃冰箱反復凍融3次，然后在4℃下以8 000×g離心5 min，通過0.22 μm過濾器并接種到7日齡SPF雞胚的卵黃膜(購自濟南斯帕法斯公司)。將雞胚置于37℃培養箱中。記錄死亡時間，并在收集死胚的肝臟提取DNA，檢測是否存在PBFDV感染。

2 結果

2.1 患病鸚鵡的臨床觀察

通過觀察，我們發現患病的灰鸚鵡精神沉郁，翅膀下的絨毛和長紅尾羽毛消失，少數腳趾脫落。尸檢后，發現肝臟彌漫性增大并易碎(圖1)。

2.2 組織病理學分析

在40倍放大顯微鏡下，我們觀察到大量上皮細胞的損失，并且細胞之間的連接性是不完整的。當使用更大的放大倍數時，我們發現少數淋巴細胞聚集并且出現散發的嗜異性細胞，表明炎癥反應。

2.3 PBFDV全基因的PCR擴增

從患病鸚鵡材料和羽毛囊組織中提取的DNA模板中擴增出PBFDV的全基因片段。瓊脂糖電泳(1.2%)證明獲得了與預期片段大小(2 000 bp)一致的清晰單一條帶(圖2A)。

2.4 重組T載體的構建與鑒定

將回收的DNA片段與pMD19-T載體連接，并轉化到Trans5α大腸桿菌(Escherichiacoli)中。在氨芐西林平板上篩選白色菌落，接種在含有氨芐西林的LB培養基中并搖動培養。通過PCR驗證陽性菌落。然后我們發現擴增了2 000 bp的條帶以確認整個基因組被插入T載體中(圖2B)。

2.5 序列同源性和系統發育分析

提取重組質粒并測序后，全基因組序列的BLAST分析顯示GenBank中PBFDV分離株的同源性為86.1%—98.8%(圖5，表1)。系統發育樹顯示PBFDV與地理位置和宿主有一定的相關性。本研究中分離的1號菌株和從波蘭分離的菌株，分離出2號和3號菌株與從英國分離的菌株在一個分支上。宿主都是灰鸚鵡，具有密切的遺傳關系(圖4)。

2.6 PBFDV對雞胚的致病性

PBFDV能延緩雞胚胎發育并導致整個身體在72 h內出血死亡(圖6A)，甚至尿囊液也變紅(圖6B)。傳代至第5代時仍然會出現這種現象。提取死亡雞胚肝臟DNA的可以擴增出目標條帶(圖2C)。PBFDV在短期內可以在SPF雞胚中復制。與此同時，我們也檢測了其他常見疾病的禽類，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒和禽腺病毒均顯示為陰性。更深入的研究還在繼續。

圖1 病鸚鵡的臨床觀察A.翅下灰絨毛的脫落；B.長紅尾羽毛脫落；C.脾臟腫大Fig.1 Clinical observation of sick parrotsA.Loss of gray wing villus.B.Loss of red tail feather.C.Enlargement of spleen

圖2 患病鳥類皮膚的組織學分析 HE染色A.C.上皮細胞的喪失和細胞連接不完整；B.淋巴細胞聚集和散在的嗜異性粒細胞Fig.2 Histology of skin in an affected bird.H&EA.C.Loss of epithelial cells and the connectivity between cells was incomplete.B.Lymphocytes clustered and sporadic heterophils

圖3 瓊脂糖凝膠電泳的結果A.從患病的非洲灰鸚鵡中擴增PBFDV的全基因組；B.重組質粒的鑒定；C.從感染的雞胚中擴增每一代PBFDV，G1—G5分別代表第一至五代Fig.3 Results of agarose gel electrophoresisA.Amplification of the full genome of PBFDV from the ill African grey parrots.B.Identification of recombinant plasmids.C.Amplification of the every generation of PBFDV from the infected chicken embryos

圖4 GenBank中收集的參考序列和本實驗獲得的基因組的遺傳進化比較Fig.4 Genetic evolution of collected sequences and reference strains in GenBank

圖5 GenBank中收集的參考序列和本實驗獲得的全基因組的同源性比較Fig.5 Homology comparison of collected sequences and reference strains in GenBank

圖6 雞胚的觀察(注射后72 h)A.注射病毒的雞胚與對照雞胚的比較；B.注射病毒的雞胚的尿囊液Fig.6 Observation of chick embryos(72 h after injection)A.Comparison of chicken embryos injected with virus and control chicken embryos.B.Allantoic fluid of chicken embryos injected with virus

表1 GenBank中一些鸚鵡喙羽病病毒的代表株Tab.1 Some representative psittacine beak and feather disease virus in GenBank

續表1

3 討論

鑒于PBFDV像其他環狀病毒類似的高度多樣性，該病毒極易突變和重組，進行全基因組分析以確定鸚鵡的當地群體中的病毒動態是有必要的。我們從3只非洲灰鸚鵡中獲得了PBFDV的基因組。這3個基因組在GenBank中可用的其他PBFDV基因組之間序列相似性為93.3%—99.9%。3個PBFDV基因組序列中的第1個與從波蘭分離株最接近，而第2和第3個與從英國分離株非常接近。總的來說，這3個基因組與其他已知的PBFDV基因組序列相似性在86.1%—98.8%之間。獲得的第一個完整基因組(GenBank登錄號MH279594)是1 991 bp，G + C含量為53.14%，而第2和3號(GenBank登錄號MH180298和MH190788)其基因組是2 000 bp，G + C含量分別為52.85%和52.95%。這3種都與其他參考PBFDV基因組相似，基本結構包括兩個主要的ORF，分別為ORF1和ORF2，且含有編碼Rep和CP的基因。這是山東省非洲灰鸚鵡PBFDV基因組的首次報道，豐富了中國東部地區獲得的PBFDV基因組數據。這種病毒最早只發現于澳大利亞的野生鸚鵡[10]，但近年來隨著世界鳥類貿易蔓延到世界大部分地區，包括英國、德國、葡萄牙、美國、南非等地[22]。起初，沒有關于中國大陸鸚鵡病暴發的報道，但隨著近年來全球鳥類貿易的迅速發展，攜帶病毒的鸚鵡將病毒帶到了中國，這項研究中的鸚鵡也是從其他地方進口的。作為一種重要的經濟動物，鸚鵡在病毒爆發時很容易造成高經濟損失，因為與其他家禽相比，它們更加昂貴。中國的鸚鵡養殖業正在興起，基本保障措施尚未完善，沒有統一的養殖標準以及應對該病毒感染的措施。

目前，對于鸚鵡或其他鳥類的圓環病毒感染沒有有效的治療方法。治療只能基于支持療法，補充免疫刺激劑和維持環境清潔。PBFDV的致病性和危害性很小，單獨感染圓環病毒時鳥類不會造成明顯的傷害。大多數感染了圓環病毒的禽類死于繼發感染病毒、細菌等。我們應該更加重視原發性繼發感染的診斷并相應地進行治療。完全滅活PBFDV非常困難，并且在未完全滅活病毒的情況下貿然對易感鳥類進行免疫，極易引起病毒感染。因此，使用來自受感染鳥類組織的全病毒滅活疫苗是非常危險的。外部病毒的持續存在和無法治愈導致科研人員將研究重點放在開發針對PBFDV的疫苗。由于還未有商品化的疫苗應用，目前的研究主要集中在重組基因亞單位疫苗的開發上，但尚處于研究階段。疫苗開發主要依靠重組DNA技術在少數表達系統中產生病毒抗原。該方法主要通過產生PBFDV的主要抗原決定簇，衣殼蛋白(CP)，由幾個群體用桿狀病毒-昆蟲細胞系統表達[23]，并且觀察到重組CP自組裝成病毒樣顆粒(VLP)[4]。該制劑用于接種Cacatuatenuirostris，并顯示可以防止PBFDV被感染[24]。然而，目前尚未報道基于可溶性PBFDV CP的亞單位疫苗的免疫原性。同樣地，PBFDV CP的N-末端部分的缺失導致昆蟲細胞中截短的CP的表達增加[23]。特別地，前40個N-末端氨基酸的缺失導致截短的蛋白質CPΔN40的表達水平增加，這有利于產量。此外，在之前的一項研究中，接種了昆蟲細胞中產生的PBFDV VLP的禽類在受到感染禽類分離的活PBFDV威脅時受到保護[4]。在大腸桿菌中表達的截短的PBFDVCPΔN40用于提高雞的抗體水平[25]。然而，在細菌或昆蟲病毒表達系統中，PBFDV CP的產量都很低[23]，這表明需要高成本才能產生足夠量的疫苗。

通過用羽毛勻漿中的純化病毒感染鸚鵡可以成功復制PBFD[26]。可以通過用來自患病鸚鵡的羽毛勻漿接種原代雞胚成纖維細胞來分離PBFDV病毒[27]。然而，其他學者的研究不能重復實驗結果[28]。在本研究中，我們使用7日齡SPF雞胚蛋黃膜作為培養條件，從死亡雞胚的肝臟DNA中擴增出目標條帶。我們的實驗結果顯示PBFDV可以通過在卵黃囊接種的方式短期內在SPF雞胚中繁殖。不同學者的研究結果不同可能的原因是選擇雞胚的日齡不同，接種位置不同，而病毒繁殖對雞胚接種位置具有特異性，很可能會導致實驗結果的差異。至于該病的預防，鸚鵡養殖場的主人應保持良好的常規飼養管理和預防措施。加強鸚鵡的營養供應，并在飼料中加入適量的維生素和微量元素，以提高免疫力。進口時，必須檢查新鳥的健康狀況。在鳥類與場地中的鳥類混合之前，必須至少兩周對鳥類進行檢查和觀察。應避免不同年齡的混合育種，必須加強進出口統一戰略。如果鳥場有可疑的爆發，我們應該快速做出確診，并且隔離病禽。同時，如果我們能夠建立可靠簡單的核酸和血清學檢測方法，進行全面系統的流行病學調查以確定阻止其水平或垂直傳播的因素，會更有利于該病的防控。

4 結論

我們的研究結果顯示了中國山東省鸚鵡養殖場PBFDV的分子特征。農場中的非洲灰鸚鵡被PBFDV污染，這可能來自鳥類貿易路線。在中國預防和控制PBFDV非常重要。我們建立了一種新型高效的PBFDV培養體系，有利于為進一步研究該病毒創造有利條件。