非洲企鵝微衛(wèi)星DNA的篩選及其遺傳多樣性分析

袁耀華 耿廣耀 楊淑慧 馬 躍 徐艷春*

(1.上海動物園，上海，200335；2.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

非洲企鵝(Spheniscusdemersus)又名斑嘴環(huán)企鵝，與麥哲倫企鵝(S.magellanicus)、加島環(huán)企鵝(S.mendiculus)、洪堡企鵝(S.humboldti)同屬企鵝目(Sphenisciformes)，企鵝科(Spheniscidae)，環(huán)企鵝屬。因為捕殺、撿拾鳥卵、石油污染、沿海生態(tài)系統(tǒng)的破壞、不斷擴大的商業(yè)捕魚、棲息地喪失、清理鳥糞做肥料等人類活動，導致野外非洲企鵝數(shù)量銳減，目前存活數(shù)目僅為80年前的2.5%[1]。20世紀末，上海動物園先后從日本、荷蘭的動物園引進非洲企鵝進行飼養(yǎng)繁殖，目前已突破人工繁育的技術(shù)問題，且建立了較大的飼養(yǎng)種群。在種群發(fā)展過程中，主要采用人工配對方式，所以后代的譜系關(guān)系不清楚；另一方面，建群者個體數(shù)目只有10只，又沒有進一步的種源引入，可能存在近親繁殖。這兩種情況都可能導致原本不太高的遺傳多樣性在今后的繼續(xù)繁殖中進一步下降。因此，對當前種群的遺傳多樣性進行系統(tǒng)研究，為種群遺傳管理提供依據(jù)。目前為止，關(guān)于非洲企鵝的研究較少，主要集中在人工繁育技術(shù)[2-3]和野外種群波動及其影響因素[4-5]等方面，關(guān)于微衛(wèi)星DNA的篩選及遺傳多樣研究等方面均未見報道。本研究利用已知的其他企鵝微衛(wèi)星基因座在非洲企鵝中進行測試，篩選擴增效果良好，且具有較高多態(tài)性的微衛(wèi)星，組成非洲企鵝微衛(wèi)星分析系統(tǒng)，并用以分析該種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料

對上海動物園飼養(yǎng)的非洲企鵝種群，除少數(shù)個體采用體檢所剩的血液樣品以外，從每只個體的胸部拔取廓羽3—5枚，裝入紙質(zhì)信封內(nèi)，通風處自然干燥，然后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。血液樣本灌注于無菌的棉紗布中，避光通風處自然干燥，裝入紙質(zhì)信封后放入-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 DNA的提取

每只個體取羽毛3枚，將羽軸基部0.5 cm處剪下，置于干凈的試管中，在95%的乙醇中震蕩漂洗5 min，轉(zhuǎn)入去離子水中漂洗5 min，然后置于TNE緩沖液洗滌中浸泡1 h。采用基因組DNA提取試劑盒(AxyPrep Biosciences，杭州)提取總DNA。干血樣品的DNA提取時，先將帶血漬的紗布剪下0.5 cm2，置于TNE緩沖液洗滌中浸泡1 h，然后采用相同的試劑盒提取總DNA。提取的DNA經(jīng)過測定OD260估算濃度，然后稀釋成10 ng/μL備用。

1.3 微衛(wèi)星位點的篩選

從參考文獻中[6-9]選擇28個微衛(wèi)星PNN01、PNN03、PNN05、PNN06、PNN07、PNN08、PNN09、PNN012、FHU2、TP500、RM6、RM3、AM12、AM13、AM3、B3-2、G3-11、G3-6、G2-2、H2-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12、SH2CA21和SH2CA22，各位點的重復單元長度為2—4 bp。用文獻中的引物和擴增條件擴增非洲企鵝DNA。擴增前，把每個位點上游引物的5′端用FAM熒光染料標記，然后進行PCR擴增。所獲得的引物序列、退火溫度等信息見表1。

表1 微衛(wèi)星位點的信息Tab.1 Information of microsatellites used in this study

續(xù)表1

PCR反應(yīng)在50 μL體系中進行，包括25 μL PrimerSTAR Max Premix(2×)(Takara，大連)，上下游引物各0.2 μmol/L，DNA模板50 ng。擴增反應(yīng)在Eppendorf Master cycler pro PCR儀上完成，98℃/10 s；(98℃/10 s，Ta/15 s，72℃/10 s)× 30 cycle；72℃/1.5 min。PCR產(chǎn)物用ABI 3100型遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)電泳分離，用GeneScan 3.1軟件(Applied Biosystems，美國)收集數(shù)據(jù)，用Genotyper 3.1軟件(Applied Biosystems，美國)測量擴增產(chǎn)物大小，并識別等位基因。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Cervus 3.0對基因型數(shù)據(jù)進行分析，得到觀測雜合度、期望雜合度、等位基因數(shù)、有效基因數(shù)、基因頻率、基因型頻率、排除率、個體識別力、親權(quán)分析等。利用軟件PopGene對該群體每個位點的Hardy-Weinberg平衡進行卡方(χ2)檢驗，利用Coancestry估計該圈養(yǎng)種群的近交系數(shù)。

2 研究結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星遺傳多樣性

相比血液樣品，羽毛樣品的總DNA提取量較少，但是所有的樣品都足夠用于微衛(wèi)星擴增。實驗發(fā)現(xiàn)，28個微衛(wèi)星中有17個在非洲企鵝上無擴增產(chǎn)物，包括PNN07、PNN08、FHU2、TP500、RM3、AM12、AM13、AM3、G3-11、G3-6、M1-11、SH1CA9、SH1CA12、SH1CA16、SH1CA17、SH2CA12和SH2CA22，其余11個有擴增產(chǎn)物，但PNN05、RM6和H2-6等3個位點表現(xiàn)為單態(tài)，PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21 8個位點具有多態(tài)性。

在46個個體中，上述8個多態(tài)位點上共檢測到34個等位基因(表2)，每個位點的等位基因數(shù)為3—6個，平均4.25個。等位基因數(shù)最多的是PNN03，共檢測到6個等位基因，其次是PNN06、PNN012和SH2CA21，均檢測到5個等位基因。在PNN09檢測到4個等位基因，PNN01、G2-2和B3-2各檢測到3個等位基因。有效等位基因數(shù)在PNN09最大，為3.56；B3-2最小為1.57，平均為2.71個。8個多態(tài)位點的觀測雜合度為0.435—0.804，平均為0.614；期望雜合度0.366—0.726，平均為0.618。8個位點中，多態(tài)性信息含量在0.330—0.667，PNN09最高為0.667，B3-2最低為0.330。通過χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，8個多態(tài)位點中PNN03顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，PNN01偏離Hardy-Weinberg平衡，其他6個位點均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.2 非親排除率與親權(quán)鑒定

依據(jù)各位點的基因頻率、基因型頻率計算各位點的非親排除概率(NEP)，各位點非親排除概率和累計排除概率見表3。對第一親本的非親排除概率為0.707—0.935，對第二親本的非親排除概率為0.536—0.814，對親本對的非親排除概率0.362—0.690。 8個多態(tài)位點雙親累計排除概率(E-PP)為0.998。

通過Cervus 3.0軟件，共鑒定出15對父-母-子，包括31個個體。據(jù)此繪制了3個譜系關(guān)系(圖1)。

2.3 個體雜合度與個體近交系數(shù)

根據(jù)各個體的基因型，計算個體雜合度與標準個體雜合度，由表4可以看出該圈養(yǎng)種群個體雜合度為0.250—1.000，標準雜合度為0.405—1.618。利用Coancestry采用LH-estimator和LR-estimator兩種估計方法估計個體近交系數(shù)，該圈養(yǎng)種群的個體近交系數(shù)的范圍為-0.304—1.617(LH-estimator)和-0.402—0.750(LR-estimator)，二者的平均值分別為0.045和0.052，從數(shù)值上看，該群體既存在近交，同時也存在明顯的近交避免機制。

表2 人工飼養(yǎng)非洲企鵝種群中8個微衛(wèi)星位點的遺傳特征Tab.2 Characteristics of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

表3 人工飼養(yǎng)非洲企鵝種群中8個微衛(wèi)星位點的非親排除概率Tab.3 Non-parent exclusive probabilities of 8 microsatellites in the captive African penguin Spheniscus demersus population

圖1 人工飼養(yǎng)非洲企鵝31只個體的譜系關(guān)系圖Fig.1 The pedigree chart of 31 captive African penguins

表4 個體雜合度與標準個體雜合度Tab.4 Multilocus heterozygosity and standard multilocus heterozygosity

3 討論

鳥類取樣一般分為3類：傷害性取樣、非傷害性取樣、非損傷取樣。傷害性取樣即殺害動物采樣或抽取1 mL以上的血液，一般不適用于珍稀鳥類。本研究采用非傷害性取樣拔取胸部廓羽和體檢剩余血液作為研究對象，雖然血液樣本中總DNA含量遠高于廓羽中總DNA含量，但在遺傳多樣性分析中胸部廓羽DNA含量和血液DNA未因含量變化發(fā)生差異。在以后相關(guān)研究中采樣可以采用非傷害性取樣，盡可能避免應(yīng)激對動物的傷害。

該研究選取了28個微衛(wèi)星引物，經(jīng)過一系列的篩選最終確定了8對具有多態(tài)性的引物。其中PNN01，PNN03，PNN06，PNN09，PNN012來源于非洲企鵝，再次證實了這5個位點在非洲企鵝中的穩(wěn)定存在，其中PNN012擴增率較其他幾個位點略低，在以后的非洲企鵝相關(guān)研究中應(yīng)該慎重考慮。SH2CA21來源于洪堡企鵝，在非洲企鵝群體中有較好的遺傳多態(tài)性，具有一定的研究價值，對以后洪堡企鵝和非洲企鵝的物種進化研究起到一定的作用。B3-2和G2-2是通過磁珠富集法獲得的位點引物，在麥哲倫企鵝和加島環(huán)企鵝種群成功擴增且有較高的多態(tài)性，本研究也證實了該位點在非洲企鵝種群中的普遍存在。SH2CA21，B3-2，G2-2位點有較好通用性，有助于企鵝目的比較遺傳圖譜的構(gòu)建。

有效等位基因數(shù)是群體隨機交配能夠穩(wěn)定遺傳給后代的基因數(shù)，等位基因數(shù)反映的是該位點的遺傳變異水平，一般等位基因數(shù)越大，該基因適應(yīng)環(huán)境變化的潛力也越大。有效等位基因數(shù)和觀察等位基因數(shù)的差值可以反映該位點等位基因丟失的風險。8個多態(tài)位點的等位基因數(shù)為3—6，平均4.25，有效等位基因為1.57—3.56，平均2.71。觀察等位基因數(shù)和有效等位基因差距較大，說明上海動物園非洲企鵝種群中有部分低頻等位基因有丟失的風險。Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示PNN03、PNN01顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，占總位點數(shù)的25%，與現(xiàn)用非隨機配對方式有關(guān)。其他6個位點未偏離Hardy-Weinberg平衡這說明現(xiàn)用配對方式對當前遺傳多樣性的影響還比較小，此時為加強遺傳管理的好時機。

采用此套遺傳標記利用Cervus 3.0軟件在親本未知情況下，鑒定出了15組血緣關(guān)系，其他個體未能成功檢出親緣關(guān)系，這可能是由親本信息未采集導致。在以后種群管理中適當增加攜帶稀有基因(P<0.05)個體的繁殖機會，以期稀有基因得以保留。

4 結(jié)論

位點PNN01、PNN03、PNN06、PNN09、PNN012、G2-2、B3-2和SH2CA21多態(tài)性較高，且累積非親排除率也較高，可以用于譜系勘誤、親權(quán)分析，在利用該研究遺傳標記進行遺傳管理時，需配合SPARKS和PMX等軟件。在條件允許的情況下，對未確定基因指紋的個體進行個體基因指紋制定，此外單個位點非親排除率較低，可以進一步尋找更多的位點提高實驗的準確性。