花鼠腦組織灌流固定方法的探究

毛劍杰 朱青青 陳 坤 周洪昌 錢 晶 潘永良

(湖州師范學院醫學院，浙江省媒介生物學與病原控制重點實驗室，湖州，313000)

腦組織形態和免疫組化、熒光等實驗應用廣泛，良好的灌流固定效果是保證實驗順利進行的重要前提[1]。一種好的灌流固定方法不僅能有效提高灌流效率，減少動物痛苦和瀕死時間，避免病理假象，還能節約固定液，最重要的是能阻止機體死亡后體內蛋白類物質急速變性，避免組織細胞在自身溶酶體酶的作用下溶解破壞，最大限度地保持組織細胞的活體狀態和抗原性[2-3]。在大鼠灌流中生理鹽水的溫度常為4℃或37℃[4-5]，以往研究尚未評價生理鹽水溫度對后續實驗如免疫組化的效果，且未有研究探討主動脈結扎對腦組織灌流效果的影響。由于小型嚙齒動物體型小，繁殖快，廣泛應用于各模型的建立[6-7]，本文旨在評估是否主動脈結扎和不同生理鹽水溫度(4℃和37℃)對花鼠(Tamiassibiricus)腦組織在體心臟灌流固定術中應用效果影響，探討出一套簡單、成功率高且適用于多數小型嚙齒動物的灌流固定方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

野生成年雄性花鼠24只，抓自黑龍江省伊春市帶嶺區(128°53′—128°55′E，47°10′—47°14′N)，體重95—110 g，單籠飼養，正常明暗周期中適應性馴養1周后隨機分成4組，每組6只。第1組：結扎腹主動脈，生理鹽水4℃；第2組：不結扎腹主動脈，生理鹽水4℃組；第3組：結扎腹主動脈，生理鹽水37℃組；第4組：不結扎腹主動脈，生理鹽水37℃組。所有關于實驗動物的操作均遵循實驗動物操作規程，并盡可能減少動物的痛苦。

1.2 主要試劑與儀器

生理鹽水及多聚甲醛溶液(41533，國藥集團化學試劑有限公司)；EDTA抗原修復液(ZLI—9066，1∶50，北京中杉公司)；山羊抗DCX抗體溶液(SC—8066，1∶2 000，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA)；生物素兔抗山羊二抗(BA—5000，1∶300，Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA)；Vector Elite ABC(PK—6100，Vector Laboratories，Inc.Burlingtone，CA，USA)；0.05%DAB(D8001，上海西格瑪奧德里奇公司，上海)；恒流蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；Leica CM1850冰凍切片機(Leica，Heidelberg，DE)。

1.3 灌流固定

腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(8 mg/100 g體重)，麻醉后迅速打開胸腔，充分暴露心臟，剪去心包組織(圖1A-C)。在心尖搏動明顯的部位插入灌流針，經左心室到達主動脈升部(肉眼可見)，剪開右心耳。打開恒流蠕動泵(圖1E)，以13 mL/min的流速從主動脈升部灌注生理鹽水，直至右心耳流出透明清亮液體，記錄生理鹽水灌流所需的時間，用于計算其用量。再繼續用4%多聚甲醛(4℃)以13 mL/min的流速灌流30 min。打開顱腔，取出腦組織(圖1F)，進行硬度測試和顏色觀察后，置于多聚甲醛溶液中后固定2 h，最后保存至4℃30%蔗糖溶液中。

1.4 硬度測試和顏色觀察

將灌流好的腦組織取出，水平放置于平整桌面，用刻度尺垂直水平桌面，測量其高度。接著將印壓計通過壓頭作用于待測組織，通過檢測其同等力度下腦袋下陷后的垂直高度，利用前后兩次高度，做差比較即可。用印壓測試的方法測試其硬度(其中壓頭重1 649.634 N)，并觀察記錄各器官(大腦、肝臟、肺臟)灌流前后的顏色變化，其具體檢測步驟參照以往文獻[8]。

1.5 冰凍切片和DCX免疫組化

腦組織在蔗糖溶液中沉底后進行冠狀切片，厚度為40 μm，分為6套。取其中一套進行DCX漂片免疫組化染色，步驟參照文獻[9-10]，并做了適當改進。步驟簡單描述如下，腦切片于EDTA抗原修復液90℃水浴孵育15 min，室溫放置25 min，0.05% H2O2中孵育30 min。之后在10%兔血清(含0.5%TritonX-100)封閉1 h后，切片在山羊抗DCX抗體溶液(1∶2 000)4℃孵育36 h，室溫2 h。生物素兔抗山羊二抗(1∶300)室溫孵育2 h，Vector Elite ABC中反應90 min。最后，用0.05%DAB 和0.009%H2O2顯色。染色后的腦片貼于防脫載玻片上，晾干后經梯度酒精(75%，95%，100%)各脫水5 min，二甲苯透明10 min，再用中性樹膠封片。為了降低染色過程中的變異性，所有染色同步進行，待腦片風干后在顯微鏡下觀察并拍照統計DCX陽性的細胞的數量。

1.6 腦片量化

對應大鼠腦圖譜[11]第29—32頁，在顯微鏡放大400倍條件下，量化兩側海馬齒狀回DCX陽性細胞并計算其密度。每個動物選取4—5張切片。

1.7 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計量資料數據以平均值±標準誤(Mean±SE)表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 圖片顯示花鼠灌流固定的一些主要步驟。打開胸腔，暴露心臟和剝開心包膜(A—C)，從左心室插入灌流針到主動脈升部，剪開右心耳和結扎腹主動脈(D)，打開蠕動泵，用生理鹽水和4%多聚甲醛灌流固定(E)，取出腦組織(F)Fig.1 Photomicrographs displaying some of the main steps of perfusion and fixation for Siberian chipmunk.Open the chest，expose the heart and peel pericardium(A-C)，pass the perfusion needle through the left ventricle into the ascending aorta，cut the right atrium and ligature the abdominal aortas(D)，run the peristalsis pump，do the perfusion and fixation with normal saline and 4% paraformaldehyde(E)，remove the brain(F)

2 結果

2.1 生理鹽水用量

雙因素方差分析表明，是否結扎腹主動脈和不同生理鹽水的溫度(4℃ 和 37℃)對灌流時生理鹽水的用量都有顯著影響。結扎腹主動脈組所需生理鹽水的用量明顯低于不結扎腹主動脈組(F(1，21)=67.53，P<0.01)；而生理鹽水4℃組所需生理鹽水的用量明顯高于37℃組(F(1，21)=4.36，P<0.05)(圖2)。

圖2 是否結扎腹主動脈及不同溫度(4℃和37℃)對腦組織灌流時生理鹽水用量的影響。*表示達到P<0.05顯著的處理效應，而希臘字母表示溫度差異。誤差線表示標準誤(SEM) Fig.2 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the volume of normal saline.* Indicates significant treatment effects at P<0.05.While Greek letters indicate temperature differences.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

2.2 腦組織的硬度

雙因素方差分析表明，是否結扎腹主動脈(F(1，21)=0.77，P>0.05)和生理鹽水的溫度(4℃ 和 37℃)(F(1，21)=2.35，P>0.05)對腦組織硬度無顯著影響(圖3)。

圖3 是否結扎腹主動脈及不同溫度(4℃和37℃)對灌流后腦組織硬度的影響。誤差線表示標準誤(SEM) Fig.3 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the hardness of brain tissue.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

2.3 各組織器官灌流前后的顏色變化

4個實驗組的腦組織顏色在灌流后均為乳白色，肺臟顏色仍為淺紅色。不結扎腹主動脈組肝臟的顏色則由原來的暗紅色明顯變白，而結扎腹主動脈組肝臟顏色沒有發生明顯變化。在結扎或非結扎組，不同溫度的生理鹽水對各組織器官顏色的變化無明顯影響。

2.4 海馬DG區DCX陽性細胞的密度

雙因素方差分析表明，是否結扎腹主動脈對DCX陽性細胞密度無顯著影響(F(1，21)=0.001，P>0.05)。生理鹽水溫度對海馬DG區DCX陽性細胞的密度有顯著影響(F(1，21)=4.37，P<0.05)。生理鹽水4℃組的海馬DG區DCX陽性細胞密度與37℃組相比顯著更高(圖4，圖5)。

圖4 是否結扎腹主動脈及溫度(4℃和37℃)對海馬DG區域被DCX標記的陽性細胞密度的影響。希臘字母表示溫度差異，誤差線代表標準誤(SEM) Fig.4 The effects of the ligation of the abdominal aortas and temperature(4 ℃ and 37 ℃)on the density of DCX-labeled cells in the dentate gyrus DG of the hippocampus.Greek letters indicate temperature differences.Error bars represent standard errors of the mean(SEM)

圖5 4℃(A)或37℃(B)生理鹽水灌流后花鼠海馬DG區域的DCX陽性染色示意圖(×100)。GCL：顆粒細胞層，MCL：分子層，Hilus：門區 Fig.5 Composed photomicrographs displaying DCX staining in the dentate gyrus DG of the hippocampus in chipmunks perfused with 4℃(A)or 37℃(B)normal saline(×100).GCL：granular cell layer of the DG，MCL：molecular cell layer of the DG

3 討論

腦組織固定常用于腦形態學研究[12]。良好的組織固定是保持細胞形態完整和抗原性的關鍵，固定可防止組織細胞的自溶與腐敗，保持細胞內蛋白質、脂肪、糖等各種成分與生活時相仿[1]，腦組織耐氧能力差，對灌流固定條件較為嚴苛，條件不當就難以完整地保留細胞內的物質[13]。由于各文獻報道的腦組織灌流固定條件有所出入，且目前尚無文章對不同條件下的固定效果做統一評價，如是否結扎腹主動脈和生理鹽水溫度，本文在此方面進行了研究并試圖探討出一套適用于多數小型嚙齒動物的灌流方法。

結扎腹主動脈組灌流時所需的生理鹽水用量少于不結扎組，省時，省液，且腦組織硬度無明顯差異，提示相比單位時間里多聚甲醛流過腦組織的量，腦組織硬度可能與多聚甲醛固定時間更有關。不論是否結扎腹主動脈，腦組織顏色均由鮮紅色轉變為均勻的乳白色，由于灌流的循環路徑不經過肺循環，因此肺臟均保持粉紅色。由于結扎了腹主動脈的實驗組在灌流時，液體只通過上腔靜脈途徑而不會經過肝臟，因此結扎組的肝臟顏色沒有發生明顯變化，始終呈現暗紅色。而在沒有結扎的實驗組中，灌流液會經下腔靜脈途徑流經肝臟，使肝臟從原來的暗紅色轉變成白色。免疫組織染色顯示，是否結扎腹主動脈對DG區DCX陽性細胞的密度沒有顯著影響，且腦組織結構清晰，神經元形態完整，印證了固定液對組織的作用時間可能比單位時間流經組織的量，更為影響灌流固定的效果，上述結果說明結扎主動脈不會影響灌流固定后續的實驗效果。

生理鹽水溫度為4℃時其用量顯著高于37℃時，這可能跟血管內皮細胞有關。以往研究發現血管內皮細胞對溫度變化很敏感，較低的溫度會引起其收縮和損傷，導致血管壁的通透性增加[14]。因此，在當前研究中，低溫(4℃)生理鹽水可能引起血管內皮細胞損傷，而使部分用于清除血液的生理鹽水滲出到組織間隙，導致需要更多的生理鹽水清除體內的血液。免疫組化結果顯示：生理鹽水4℃時，DCX陽性細胞密度明顯高于37℃，說明灌流溫度對DCX陽性細胞的表達存在影響。打開動物胸腔后，大腦缺血缺氧，導致機體開始死亡。以往的研究發現，神經細胞對氧氣高度敏感，降低溫度可以減少腦組織氧耗并通過降低無氧代謝率來防止腦組織中乳酸堆積，因而可增加神經細胞對缺氧缺血的耐受性從而延緩神經細胞的凋亡[15-16]。因此，低溫生理鹽水灌注可能延緩了機體死亡后因缺氧引起的DCX陽性細胞的凋亡。

經過此次實驗探討，本文總結出了一套簡單且適用于小型嚙齒動物免疫組化的灌流方式，即采用左心室心尖入針到達主動脈升部，在結扎腹主動脈后，用4℃的生理鹽水快速清除體內的血液，再用4℃的4%的多聚甲醛進行灌流固定，該方法操作簡單，省時、省液，有效提高灌流固定效果。

致謝：感謝湖州師范學院醫學院張孝利、聞佳穎、楊雨晨同學在實驗開展過程中的幫助。