DNA條形碼技術鑒定黃頰長臂猿與白頰長臂猿

孫偉東 陳 蓉 傅兆水

(南京市紅山森林動物園管理處，南京，210028)

長臂猿科(Hylobatidae)分為4個屬(Nomascus，Symphalangus，Hylobates，Hoolock)17個種，其中我國分布有3屬6種[1]。冠長臂猿屬IUCN瀕危物種，其家族成員中的北部白頰長臂猿(Nomascusleucogenys)、南部白頰長臂猿(Nomascussiki)、黃頰長臂猿(Nomascusgabriellae)間的形態差異極小，外觀不易區分。其中，動物園飼養較多的黃頰長臂猿和白頰長臂猿體毛長而粗糙，雄性均以黑色為主，混有不明顯的銀色，區別僅為黃頰長臂猿面頰的兩旁從嘴角至耳朵的上方各有一塊橘紅色或黃色的毛，白頰長臂猿為白色或黃色的毛。兩個物種的雌性腹部均沒有黑色的毛，僅黃頰長臂猿雌性體毛通常為棕黃色，白頰長臂猿雌性體毛為橘黃色至乳白色。通過黃頰長臂猿和白頰長臂猿外形來區分是非常困難的，由于僅有地域隔離而沒有生殖隔離，導致遷地保護中出現了黃頰長臂猿和白頰長臂猿的雜交現象。由于上述原因，存在黃頰長臂猿和白頰長臂猿種間雜交等問題，長此以往，對該物種的遷地保護是極其不利的。 因此，需要借助分子遺傳學的方法輔助鑒定長臂猿的物種，以避免這一現象的產生。

mtDNA分子標記作為一種母系遺傳的生物大分子，是研究物種內遺傳多樣性及種上系統分類關系的有力工具，特別是線粒體細胞色素 C 氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit I，COI)，是目前研究種和種下水平分子系統的首選標記。本文利用mtDNA物種鑒定技術，設計合成冠長臂猿屬COI序列的引物，對21只長臂猿進行物種鑒定，NJ樹顯示2只雄性長臂猿為南部白頰長臂猿，其余19只均為黃頰長臂猿。該方法能有效區分冠長臂猿屬下的黃頰長臂猿和白頰長臂猿，為這幾個物種的遷地保護提供管理依據。

1 材料與方法

1.1 材料

來自南京紅山森林動物園圈養條件下的21只長臂猿(基本信息見表1)，采集帶毛囊的毛發樣本放于-20℃保存。

表1 21只長臂猿基本信息Tab.1 Basic information of 21 gibbons

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組提取試劑盒、TaqPlus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料購自天根生化科技(北京)有限公司。引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

梯度PCR儀購自杭州龍揚儀器公司。凝膠成像系統購自上海歐翔儀器公司。水平電泳儀購自北京君意東方有限公司。高速冷凍儀離心機購自上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.3 基因組DNA提取

按微量基因組提取試劑盒說明書提取長臂猿毛囊中的基因組DNA。提取后的基因組DNA樣本于-20℃保存，備用。

1.4 引物設計和篩選

根據NCBI數據庫中，相近物種的COI序列進行比對，設計出3對引物(COI F1/R1，COI F2/R2，COI F3/R3)，序列見表2，進行PCR篩選。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

1.5 PCR擴增

利用引物(COI F1/COI R1)進行擴增。反應體系為：Mix 12.5 μL，COI F 0.5 μL，COI R 0.5 μL，雙蒸水6.5 μL，DNA模板5 μL。反應條件為：94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃ 10 min。

1.6 電泳

取10 μL PCR擴增產物，在2%的瓊脂糖凝膠上電泳30 min，通過凝膠成像儀進行拍照記錄結果。電泳結果中，目標條帶大小約750—500 bp。

1.7 序列測序與分析

將PCR產物送至金斯瑞生物技術有限公司進行克隆測序。測序獲得序列利用DNAstar軟件包中的SeqMen軟件進行拼接，舍棄兩端低信號序列，結合測序峰圖，對序列內部位點進行人工校對。確定序列后，將校準后的序列輸出為FASTA格式的文本文件，利用BLAST比對確認，獲得序列為目的序列。將目的序列與黃頰長臂猿N.gab1(HQ622807.1)、黃頰長臂猿N.gab2(HQ622806.1)、北方白頰長臂猿N.leu(KC757404.1)、南方白頰長臂猿 N.siki(HQ622805.1)采用Clustalx軟件對基因序列進行比對分析。將其比對結果轉換成Mega格式，用Mega 4軟件計算序列間堿基對差異、轉換、顛換，采用Maximum composite likelihood等模型，構建NJ樹。NJ樹分支的置信度均采用自展法1 000次重復檢驗。

2 結果

2.1 RCR檢測方法的建立

以長臂猿線粒體DNA為模板，用3對引物進行PCR擴增，結果引物COI F1/R1能擴增與預期一致的特異性DNA 片段(約500 bp)(圖1)。進一步切膠回收DNA測序，并進行序列分析，確證2條特異性引物間的序列為COI序列(515 bp)。

圖1 COI引物建立Fig.1 COI primer establishment注：1.D2000Maker；2.引物COI F1/R1；3.引物COI F2/R2；4.引物COI F3/R3Note：1.D2000Maker.2.Primer COI F1/R1.3.Primer COI F2/R2.4.Primer COI F3/R3

2.2 COI PCR擴增結果

利用COI F1/R1對21只冠長臂猿進行PCR擴增，均擴增出515 bp的目的條帶(圖2，圖3)。

圖2 COI PCR擴增結果Fig.2 The amplification results of COI PCR注：1.D2000Maker；2-17.樣本1-16號Note：1.D2000Maker.2-17.Sample 1-16

2.3 進化樹分析

測序獲得序列利用DNAstar軟件包中的SeqMen軟件進行拼接，校對。采用Clustalx軟件對基因序列進行比對分析。用Mega4軟件采用Maximum composite likelihood等模型，構建NJ樹。系統樹分支的置信度均采用自展法1 000次重復檢驗。

圖3 COI PCR擴增結果Fig.3 The amplification results of COI PCR注：1.D2000Maker；2-6.樣本17-21號Note：1.D2000Maker.2-6.Sample 17-21

如圖4可見，長臂猿Lianlian和Dazai與N.siki在一個分支上，其余19只長臂猿均在N.gab分支上。其中，可以發現種群中的Dahuang家族成員(Yuanyuan，Dongzhi，Lele，Xiatian)和Erhuang家族成員(Fangfang，Yuanbao，Wuming，Yaqing)在分支上比較接近。進化樹上，黃頰長臂猿和白頰長臂猿均有明顯的分支，能夠區分這幾個物種。

3 討論

隨著標準數據庫的建立，基于COI基因的DNA barcode在動物分類學和生態學中得到了廣泛應用[2]。由于常采用基于形態特征的工作方式，傳統分類學要將這些物種納入記錄，而獲取相關知識有許多困難。在記錄新物種的工作中引入COI基因以后可以快速給物種分群，在一定條件下還可以快速判定物種樣品是否來源于已知物[3]。這種快速判斷在某些情況下顯得尤為重要。此外，因為傳統分類學大多數情況下有更加關注成年個體的傾向，對幼體經常描述不夠詳細，導致對許多物種辨別能力不足，DNA barcode方法則沒有這種限制。另外，在缺乏形態變化的動物類群中，依賴形態特征的工作方式往往會導致混亂和錯誤[4]。

圖4 長臂猿NJ進化樹Fig.4 The NJ evolution tree of the gibbons

目前，本文通過近物種COI序列進行引物設計和篩選，建立了對黃頰長臂猿和白頰長臂猿的鑒定方法。 運用該方法對21只冠長臂猿進行物種鑒定，NJ樹結果顯示2只雄性長臂猿在南部白頰長臂猿的分支上，同時，對其外觀進行觀察，體毛為黑色，唯兩頰各具一大塊白毛，符合白頰長臂猿的外形特征。其余19只長臂猿與黃頰長臂猿在一個分支上，經COI序列鑒定為黃頰長臂猿，比對其外觀，符合黃頰長臂猿特征。NJ樹上，冠長臂猿屬的各物種均有明顯的分支，能夠明顯區分。因此，將COI序列鑒定與外形特征結合，能準確對黃頰長臂猿和白頰長臂猿進行物種鑒定。

根據物種鑒定結果，建議將這2只白頰長臂猿與黃頰長臂猿分開飼養管理，防止因種間雜交造成的瀕危物種基因污染。此外，這2只白頰長臂猿(Dazai和Lianlian)已成年，可以考慮為其引進雌性白頰長臂猿進行配對繁殖。

種群管理對物種保護非常重要，其管理的目標應是維持種群的多樣性達到可持續發展。隨著技術水平的推進，管理種群不應只停留在宏觀的記錄和調控上，應逐步運用遺傳學、生態學等原理，結合分子技術來了解和運用表觀現象后的科學原理。尤其是大種群或群居動物，作為在物種保護中起重要作用的動物園，需要對物種的過去(來源——是否有親緣關系)、現在(種或亞種類型、種群的遺傳多樣性)有充分的了解，才能對其未來(是否有足夠的遺傳多樣性來對抗疾病、來繁殖配對等)進行規劃。這些都必須而且一定要建立在科學技術的基礎上。