利用Illumina測序技術分析圈養成年滇金絲猴腸道菌群多樣性

金 潔 張飛燕 謝麗分 劉 超 張慶宇 鄔繼文 呂龍寶，2*

(1.中國科學院昆明動物研究所，昆明，650000；2.中國科學院昆明靈長類研究中心，昆明，650223)

滇金絲猴(Rhinopithecusbieti)是中國特有的珍稀瀕危動物，也是世界自然保護聯盟(IUCN)紅色名錄中的瀕危(EN)物種，其珍貴程度與大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)齊名。滇金絲猴是全世界除了人類之外，棲息地海拔最高的靈長類動物，僅分布于我國西南橫斷山脈，金沙江、瀾滄江和怒江之間滇西北和藏東南的狹小區域，海拔2 800—5 000 m之間的高山針葉林和狹長針闊混交林中，總數約3 000只。滇金絲猴不僅具有重大的觀賞和經濟價值，還有很高的醫學研究價值。目前人工圈養滇金絲猴數量不到30只。在滇金絲猴的人工飼養和繁育中，動物腸道菌群結構的改變與失衡常引起其腹瀉、消化吸收功能障礙、二重感染等疾病。胃腸道微生物的研究和利用是野生動物繁殖及種群保護的重要措施[1]。

腸道微生物直接參與宿主的食物消化、營養吸收、能量代謝、免疫應答等諸多生理活動[2]，維持腸道微生態平衡，提高食物消化利用率，減少腸道疾病發生，對滇金絲猴個體健康和人工繁育至關重要。目前，針對滇金絲猴腸道菌群的研究較少，其整個胃腸道菌群的信息仍處于未知狀態。本研究利用高通量測序，彌補了傳統培養技術耗時長、不能完全反映樣本中微生物信息等缺陷，全面解析了滇金絲猴的腸道菌群結構，旨在為滇金絲猴營養與健康的研究提供參考依據，對開展人工飼養、繁育和改良飼料配方均具有重要的理論和指導意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在中國科學院昆明靈長類研究中心，采集5只圈養成年(5—10歲)滇金絲猴的新鮮糞便于采糞管中，迅速放到液氮罐中帶回實驗室。在無菌條件下取糞便內部分裝并分別編號R1—R5，其中R1—R4為健康滇金絲猴糞便，R5為亞健康滇金絲猴的半干糞便，置于-80℃冰箱中保存。采樣的健康滇金絲猴精神狀況和食欲良好，以人工飼料為食并輔有蒸糕、蘋果或紅薯，亞健康滇金絲猴精神狀況和食欲較健康猴差，僅以蒸糕為食，且體重遠低于健康滇金絲猴。

1.2 細菌總DNA提取和PCR擴增

使用MOBIO公司PowerFecalTMDNA試劑盒，按照說明書上操作步驟抽提細菌基因組DNA。抽提完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測儀檢測DNA質量。以滇金絲猴腸道內容物總DNA為模板，針對16S rRNA V3-V4區合成特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細菌DNA進行擴增，使用的PCR儀為ABI GeneAmp 9700型。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.3 PCR產物的混樣和純化

PCR產物質量合格后，根據其濃度進行等量混樣，充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產物，切膠回收目的條帶。產物純化試劑盒使用的是Axygen公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。

1.4 文庫構建及測序

連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段后進行文庫模板的富集和氫氧化鈉變性，構建好的文庫經Qubit定量和檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序。測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.5 高通量測序數據處理與分析

使用Cutadapt軟件reads進行剪切，根據Barcode拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列得到原始數據。原始數據經FLASH拼接、QIIME過濾、UCHIMEAlgorithm去除嵌合體后得到有效數據，在97%的相似度水平下進行聚類和物種注釋。使用QIIME軟件計算每個樣品的Alpha多樣性指數；用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線；用KEGG數據庫進行PICRUSt基因預測，并在各個分類水平上進行物種組成及多樣性分析。

2 結果

2.1 樣品序列與OTU聚類

經Illumina HiSeq測序平臺得到原始數據后進行拼接和質控，得到Clean Tags，再進行嵌合體過濾，5個樣品共得到60 598條可用于后續分析的有效數據。對所有樣品的有效數據進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成為 OTUs。5個樣品共產生791條不同OTU，其中R5樣品中OTU(592條)最多，R3樣品中OTU(479條)最少，說明R5樣品中細菌物種最多，R3樣品中細菌物種最少。

2.2 細菌群落豐富度和多樣性分析

稀釋曲線是描述樣品多樣性的曲線，如圖1A所示，曲線在序列數為60 598條后趨向平坦，說明測序已包含絕大多數樣本信息。Rank abundance曲線可反映樣品中物種的豐富度和均勻度，如圖1B所示，物種豐富度的大小依次為 R5、R1、R4、R2、R3，與上述結論一致。綜上，此次測序數據量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有細菌。

Alpha多樣性用于分析樣品內的微生物群落多樣性，表1列舉了5個樣品的菌群多樣性(Shannon)和菌群豐度指數(Chao1和 Ace)。由表1可知，R5的細菌菌群豐富度最高，其次是R1、R4、R2、R3；R1的細菌多樣性最豐富，其次是R4、R5、R2、R3。此外，覆蓋率指數越接近于1，表明測序深度已基本覆蓋到樣品中所有的物種，本研究中各樣品如表1中所示覆蓋指數均大于0.99，說明樣本中序列沒有被測出的概率極低。

圖1 稀釋曲線和rank abundance曲線Fig.1 Rarefaction curve and rank abundance plot

表1 樣品中細菌Alpha多樣性指數Tab.1 Alpha diversity of bacteria in samples

2.3 滇金絲猴腸道細菌的組成分析

采用Mothur方法注釋得到12個門(phylum)19個綱(class)，31個目(order)47個科(family)，82個屬(genus)，65個種(species)。

2.3.1 門分類水平上的細菌組成

從門分類水平，按相對豐度前10作圖(圖2)。R1—R4 4組健康滇金絲猴腸道內平均相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細菌有厚壁菌門(Firmicutes，78.41%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，18.97%)，R5亞健康滇金絲猴腸道內相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細菌有厚壁菌門(78.93%)、擬桿菌門(8.13%)、螺旋體門(Spirochaetes，6.09%)、變形菌門(Proteobacteria，3.09%)。由此可見，厚壁菌門、擬桿菌門是健康滇金絲猴腸道菌群中的優勢菌群。

2.3.2 屬分類水平上的細菌組成

由于從種水平起分類較多，因此選擇在屬水平作聚類分析，按相對豐度平均值排名前 10 的菌屬作聚類熱圖(圖3)。R1—R4 4組健康滇金絲猴腸道內平均相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細菌有瘤胃球菌屬(Ruminococcus，6.29%)、未分類的毛螺菌科(unidentified Lachnospiraceae，4.20%)成員、普氏菌屬(Prevotella，3.24%)。R5亞健康滇金絲猴腸道內相對豐度高于3%(不包含未知菌種)的細菌有梭菌屬(Clostridum，10.19%)、厭氧原體屬(Anaeroplasma，6.09%)、琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio，7.06%)、 瘤胃球菌屬(4.70%)。

圖2 門水平細菌群落結構及分布Fig.2 Bacterial communities and distribution of the samples at the phylum level

圖3 屬水平細菌聚類熱圖Fig.3 Heatmap at genus level

2.4 PICRUSt基因預測

采用PICRUSt方法預測滇金絲猴潛在的腸道微生物基因功能，如圖4所示共獲得6大類功能(不包含未分類和未知的)：細胞工程、環境信息處理、遺傳信息工程、人類疾病、代謝作用、有機體系統?；蝾A測熱圖結果表明各樣品的基因功能存在一定差異，其中R1腸道微生物在遺傳信息工程方面的功能較豐富，R4在代謝作用上的功能較豐富，R5在有機體系統、環境信息處理、細胞工程和人類疾病方面的功能較豐富，R2和R3腸道微生物的各功能豐富度較相似。同時，比較功能基因所在KEGG通路上的豐度差異(圖5)，在各大類功能中豐度最高的分別為：細胞遷移、膜轉運、DNA的復制與修復、傳染病、碳水化合物代謝、內分泌系統。

圖4 PICRUSt基因預測聚類熱圖Fig.4 Heatmap of PICRUSt gene predicted function

圖5 KEGG數據庫預測結果統計圖Fig.5 Statistical chart of predicted results from KEGG database

3 討論

本試驗采集了4只健康滇金絲猴糞樣和1只亞健康滇金絲猴糞樣，利用Illumina MiSeq高通量測序分析后共鑒定出12個門、19個綱、31個目、47個科、82個屬和65個種。通過稀釋曲線、Rank abundance曲線和Alpha多樣性指數進行樣本的復雜度分析，測序深度已基本覆蓋腸道內所有細菌，且各組樣品豐富度和均勻度較好，克服了傳統分離培養方法難以培養厭氧細菌、耗時、數據不全面等缺點。5只滇金絲猴腸道微生物的種類和數量不完全相同，可能是動物的生理狀況有一定差異所致。

研究發現健康滇金絲猴腸道共同優勢菌群有：厚壁菌門(78.41%)、擬桿菌門(18.97%)，與先前的研究結果相似：非人靈長類動物腸道的優勢菌群為厚壁菌門(65%—79%)、擬桿菌門(5.5%—19.3%)[3]。中國恒河猴(Macacamulatta)的腸道優勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門(Actinobacteria)和螺旋體門[4]，神農架川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)的優勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和變形菌門[5]，川金絲猴優勢菌群有：厚壁菌門(70.35%)、擬桿菌門(21.35%)[6]，這一結果的產生可能是由于滇金絲猴和恒河猴、神農架川金絲猴的飲食結構和生存環境存在差異[7]。此外，科學家通過溫度梯度凝膠電泳(TGGE)比較野生和圈養的大猩猩(Gorillagorilla)腸道微生物組成，發現圈養和野生的同一種靈長類動物其腸道菌群的多樣性存在差異[8]。

厚壁菌門和擬桿菌門是人和非人靈長類動物腸道共同的優勢菌門[9]，可降解食物中難分解的成分[10]。非人靈長類動物腸道中2者所占比例之和為70.50%—98.30%[3]。高比例的厚壁菌門會導致腸道吸收卡路里的效率升高，促進機體肥胖[11]。在滇金絲猴腸道中，擬桿菌門所占的比例越高，動物健康狀況越好[12]。此外，豐度前10的還有纖維桿菌門(Fibrobacteres)，該菌門能消化纖維素，常存在于反芻動物的瘤胃中[13]。這一菌群的出現解釋了滇金絲猴作為植食性動物的消化機制，暗示其腸道菌群組成與反芻動物菌群組成有相似之處[14]。本研究中亞健康滇金絲猴的優勢菌群有：厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門、變形菌門，其中螺旋體門和變形菌門的含量較健康滇金絲猴顯著增加。螺旋體門和變形菌門都分別包括多種致病菌，如：螺旋體(Spirochaeta)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)等[15-16]，降低動物腸道中螺旋體門和變形菌門的比例，個體的健康狀況可能會得到進一步改善。在屬水平上，瘤胃球菌屬占有較高比例，助于細胞吸收糖分，利于食物的消化吸收[17]。毛螺菌科(Lachnospiraceae)的細菌參與纖維素的降解[18]，產生揮發性脂肪酸為機體及腸道微生物提供能量。研究顯示，草食動物腸道內包括毛螺旋菌科、纖維桿菌屬(Cellulosimicrobium)等細菌與其食草特性相關[19-20]。本次試驗中，健康滇金絲猴腸道中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)含量較低(豐度未進前10)，但普氏菌屬(Prevotella)含量較高，其可作為益生菌替代菌分解食物中的糖類[3]。腸道中的擬桿菌屬(Bacteroides)有助于碳水化合物的分解。R5滇金絲猴腸道中毛螺菌科成員含量較低，但其含有的優勢菌群梭菌屬(Clostridum)和厭氧原體屬(Anaeroplasma)都與纖維素降解有關[21]；琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)可利用糖分解產生的有機酸，使胃中產生的有機酸不會積聚，但其在R5中大量出現的原因有待探討。雖然R5與R1—R4的優勢菌群有所差異，但這些菌群都具有同一作用：參與纖維素的降解，造成這一差異的原因可能與動物的個體和飲食有關。滇金絲猴常攝入纖維素含量較高的植物，通過分析其腸道菌群的組成，發現滇金絲猴腸道微生物種類與其食性是密切相關的。

腸道微生物與機體的免疫功能、消化和吸收、酶代謝作用等有關[22]。研究表明，人類腸道中微生物失衡可導致過敏[23]、肥胖[24]和糖尿病等[25]。由此可見，腸道微生物對機體的生理功能有一定的影響。PICRUSt將不可視的微生物，通過與數據庫比對和生物功能聯系起來。PICRUSt基因預測熱圖顯示，相同功能各樣品間熱圖顏色不同，說明各樣品雖然都具有相同的功能，但是由于每個樣品中所含微生物的種類和數量有區別，導致各樣品的效能存在差異。PICRUSt基因預測表明滇金絲猴腸道中大部分細菌與機體代謝、膜轉運和遺傳信息處理功能有關。腸道菌群與宿主同步進化，以微妙的方式影響宿主，適應不同的生理和病理狀態。破壞正常菌群的結構可能會對這些代謝通路產生阻礙。數以萬億的細菌棲息在動物腸道內，反映了個體健康、亞健康、疾病狀況和疾病轉歸[26]，由于人類對腸道菌群基因組的認識有限，此次試驗尚有部分基因和功能未知，未來我們會針對性的研究患病和健康個體，以期發現腸道菌群變化與疾病之間的潛在關系。

4 小結

本研究得到圈養條件下成年健康滇金絲猴的菌群結構，為滇金絲猴疾病監測及人工飼料的研究提供數據，以期在對滇金絲猴腸道菌群實時監測的過程中改善其腸道微生物，達到保護和增殖瀕危動物的目的。