外周血SEPT9基因甲基化檢測聯合糖蛋白腫瘤標志物在結直腸癌診斷中的應用

冷 霞 王芳軍 周 培 高 昳 仲芹芹 劉鵬飛* 陳衛昌

江蘇省江陰市人民醫院消化內科1(214400) 蘇州大學附屬第一醫院消化內科2

背景：SEPT9基因甲基化是結直腸癌的特異性生物標志物，測定其外周血表達水平可評估受檢者結直腸癌的患病風險。目的：初步探討外周血SEPT9基因甲基化檢測聯合糖蛋白腫瘤標志物在結直腸癌診斷中的臨床意義。方法：納入2016年12月—2017年4月蘇州大學附屬第一醫院診斷的正常對照組57例、腺瘤組61例和結直腸癌組71例患者，應用PCR熒光探針法測定外周血SEPT9基因甲基化情況，測定腫瘤標志物CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211水平，采用ROC曲線分析各指標診斷結直腸癌的價值。建立Logistic回歸方程，評估SEPT9聯合CEA診斷結直腸癌的價值。結果：正常對照組、腺瘤組、結直腸癌組的SEPT9基因甲基化陽性率分別為0、6.6%、52.1%。結直腸癌組CEA水平顯著高于正常對照組、腺瘤組(P<0.05)。ROC曲線分析顯示，SEPT9、CEA以及兩者聯合診斷結直腸癌的AUC分別為0.817、0.707和0.793。Logistic回歸分析顯示，SEPT9、CEA診斷結直腸癌的OR值分別為1.394(1.198～1.762)、1.325(0.997～1.622)。結論：隨著疾病進展，外周血SEPT9基因甲基化率明顯升高，對結直腸癌的診斷價值較高。聯合外周血SEPT9基因甲基化和CEA有助于提高結直腸癌的早期篩查率。

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是我國常見的消化道腫瘤，根據《中國腫瘤登記年報》顯示，其發病率為33.1/10萬，同期死亡率為15.9/10萬，位居惡性腫瘤死亡率的第5位，且發病率、死亡率正逐年升高[1]。CRC的轉歸和預后與疾病分期有關，早期CRC患者的5年生存率可超過90%[2]，但60%～70%的患者在首次確診時即為中晚期病變。大多數CRC由結直腸腺瘤發展而來，早期發現并切除腺瘤可明顯降低CRC的發病率和死亡率[3]，故普及CRC早期篩查和推廣內鏡下早診早治具有重要意義。目前結腸鏡聯合病理檢查是診斷CRC的金標準，但其為侵入性操作，充分的腸道準備、隱私暴露、受檢者本身的恐懼心理等因素限制了其廣泛應用于人群篩查。因此，亟需發展診斷效能高的無創檢查，以提高CRC的早期檢出率。

有研究[4]發現，隨著腫瘤細胞DNA釋放，外周血可檢測到SEPT9基因高甲基化，可作為CRC的特異性腫瘤標志物，具有較高的敏感性和特異性；SEPT9基因甲基化與CRC分期呈正相關，而與性別和腫瘤部位無關。臨床上用于篩查CRC的糖蛋白腫瘤標志物包括CEA、CA19-9、CA125、CA72-4等，多項標志物聯合檢測有助于提高診斷CRC的敏感性[5]。此外，血液標本易采集，受檢者依從性較高。本研究通過檢測腺瘤、CRC中外周血SEPT9基因甲基化情況和五項腫瘤標志物水平，旨在評估聯合SEPT9和糖蛋白腫瘤標志物對CRC的診斷價值。

對象與方法

一、研究對象

選取2016年12月—2017年4月蘇州大學附屬第一醫院消化內科、普外科就診的196例患者。所有入選者既往均無其他惡性腫瘤病史，未接受過放化療，女性均為非妊娠期。腺瘤和CRC患者經結腸鏡和病理檢查證實且未接受治療，以結腸鏡下未見異常者作為正常對照組。入選者均在內鏡下治療和外科手術前采集外周血標本。本研究方案通過蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會審核，所有入組患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 外周血標本采集：使用BD Vacutainer?K2EDTA采血管采集10 mL外周血標本，1 350×g離心12 min，提取3.5 mL血漿，-20 ℃保存備用，4周內完成檢測。

2. SEPT9基因甲基化檢測：由南京道奇科技有限公司提供試劑盒(PCR熒光探針法)，并進行單盲檢測。按試劑盒說明書操作，主要步驟包括裂解、DNA結合、DNA洗滌、DNA洗脫、亞硫酸鹽轉化、PCR。以β-actin作為內參照，行1次PCR，其起峰反應循環數(Ct)≤閾值(41.0)判定為陽性，高于閾值判定為陰性。

3. 糖蛋白腫瘤標志物的檢測：采用電化學發光法定量檢測CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211，正常上限值(ULN)分別為5.0 ng/mL、35.0 U/mL、37.0 U/mL、8.2 U/mL、2.08 U/mL。≥ULN判定為陽性，

4. 病理檢查：所有病理結果均由病理科高年資醫師診斷。有癌變者為CRC組，并根據內鏡檢查、影像學檢查和術后病理檢查等結果，按照AJCC第七版標準，綜合判定臨床分期。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料

共納入196例受檢者，標本溶血5例，術后病理檢查證實為神經內分泌腫瘤2例，故有效樣本共計189例，其中男性117例，女性72例，平均年齡為(57.75±12.36)歲。正常對照組57名，其中男性31名，女性26名，平均年齡(50.54±12.34)歲；腺瘤組61例，其中男性41例，女性20例，平均年齡(59.77±10.69)歲；CRC組71例，其中男性45例，女性26例，平均年齡(61.79±11.30)歲。

二、外周血SEPT9基因甲基化情況

正常對照組、腺瘤組、CRC組SEPT9基因甲基化陽性率分別為0(0/57)、6.6%(4/61)和52.1%(37/71)。CRC組甲基化陽性率顯著高于正常對照組、腺瘤組，差異有統計學意義(χ2值分別為39.28、29.71，P<0.01)，而后兩組之間差異無統計學意義(χ2=2.13，P>0.05)。

三、SEPT9基因甲基化在CRC不同分期中的陽性率

CRC組中Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期SEPT9基因甲基化陽性率分別為14.3%(1/7)、40.7%(11/27)、61.5%(16/26)、81.8%(9/11)，不同分期之間甲基化陽性率相比差異有統計學意義(χ2=10.228，P<0.05)(圖1)。

四、腫瘤標志物水平

135例受檢者具有完整的CEA、CA125、CA19-9、CA72-4、CA211數據，其中正常對照組30例，腺瘤組43例，CRC組62例。正常對照組、腺瘤組各腫瘤標志物水平相比差異無統計學意義(P>0.05)。正常對照組、腺瘤組CEA水平均顯著低于CRC組(P<0.05)，而CA125、CA72-4均無明顯差異(P>0.05)；正常對照組CA19-9和CA211顯著低于CRC組(P<0.05)，腺瘤組與CRC組無明顯差異(P>0.05)(表1)。

五、診斷CRC的效能

五項糖蛋白腫瘤標志物中，CEA對CRC的診斷效能較高(表2)。SEPT9的Ct臨界值為41.43，診斷CRC的敏感性為43.6%，特異性為100%，AUC為0.817；CEA的臨界值為2.96 ng/mL，診斷CRC的敏感性為42.9%，特異性為90.0%，AUC為0.707。SEPT9與CEA的診斷敏感性、特異性相比差異均無統計學意義(P>0.05)。SEPT9聯合CEA(任一陽性判定為陽性，兩項均陰性則判定為陰性)診斷CRC的敏感性為79.0%，特異性為86.7%，AUC為0.793(圖2)。

運用Logistic回歸建立回歸方程，Y=1/[1+EXP(0.332×SEPT9+0.282×CEA-1.550)]，SEPT9、CEA的OR值分別為1.394(1.198～1.762)、1.325(0.997～1.622)。

討 論

目前已發現人類共有13個septin基因，分別命名為SEPT1～SEPT12以及SEPT14，其蛋白產物隔膜蛋白(septins)是一組具有GTP結合蛋白活性的保守骨架蛋白家族，參與細胞骨架形成、細胞極化、胞質分裂、細胞膜重構等多個生物學過程[6]。SEPT9的轉錄產物在septins八聚體復合物中位于末端位置，能穩定多聚體結構以及促進亞基聚合[7]，在子細胞胞質的最終分離中起有重要作用[8]，因此，SEPT9基因的異常表達可能影響細胞分裂。Wasserkort等[9]的研究發現，在CRC組織中可見SEPT9-V2轉錄本的CpG島3(CGI3)高甲基化現象，而正常組織中很少見，這成為SEPT9基因甲基化檢測運用于CRC篩查的理論基礎。

近年多項研究顯示，SEPT9基因檢測在CRC篩查中的敏感性為67%～75%，特異性為89%～94%，對腺瘤的敏感性為11%～19%，特異性為85%～94%[10-11]。本研究中，SEPT9基因甲基化在CRC中的檢出率為52.1%，腺瘤中的檢出率僅為6.6%。結果差異可能是由于上述研究多使用Epi proColon 2.0試劑盒，采用1/3或2/3算法(3次PCR中1次或2次為陽性則判定為陽性)，而本研究采用國產試劑盒，將原本3次PCR簡化至1次，雖然減少了檢測成本，但可能在一定程度上降低了檢測精度。吳東等[12]應用同種試劑盒發現診斷CRC的敏感性達80.0%，特異性為95.3%，但該研究納入的樣本為CRC高危人群，驗前概率較高，同時不能排除地區差異可能。本研究中，腺瘤組的檢出率為6.6%，與正常對照組相比無明顯差異，提示SEPT9單獨用于篩查腺瘤的作用有限。此外，本研究還發現，進展期CRC的SEPT9檢出率顯著高于早期CRC，與國內外文獻報道一致[10-11]。隨著CRC病程進展，更多的腫瘤細胞壞死并釋放甲基化SEPT9基因進入外周血，導致檢出率升高。

圖1 CRC不同分期中SEPT9基因甲基化的陽性率

圖2 SEPT9、CEA以及兩者聯合診斷CRC的ROC曲線

表1 三組各腫瘤標志物水平[M(P25，P75)]

*正常對照組與腺瘤組比較；#腺瘤組與CRC組比較；▲正常對照組與CRC組比較

表2 各腫瘤標志物診斷CRC的效能(%)

*任一項腫瘤指標陽性判定為陽性，五項均陰性判定為陰性

本研究中，五項腫瘤指標聯合診斷CRC的敏感性為72.6%，特異性為70.0%。糖蛋白腫瘤標志物在多種消化系統惡性腫瘤中不同程度升高，對CRC的特異性較差，但血液標本易采集，檢測方法便捷，受試者接受程度較高，較適用于大樣本人群普查。五項腫瘤標志物中，僅CEA水平在CRC組與正常對照組、腺瘤組中的差異有統計學意義。CEA診斷CRC的敏感性為42.9%，特異性為90.0%，與SEPT9基因甲基化相比差異無統計學意義。但吸煙[13]、潰瘍性結腸炎[14]、自身免疫性疾病[15]等亦可引起CEA水平升高，而SEPT9基因甲基化結果不受年齡、性別、腫瘤部位等因素的影響[4]。兩者聯合診斷CRC的敏感性可提升至79.0%，特異性仍維持在85%以上。ROC曲線示SEPT9、CEA的AUC分別為0.817、0.707，兩者聯合的AUC為0.793，略低于單獨SEPT9。因此，在CRC高危人群中應用SEPT9聯合CEA檢查，有利于下一步篩查方法的選擇，提高受試者對結腸鏡的依從性。

本研究尚有不足之處，首先未比較SEPT9基因甲基化情況在不同臨床特征CRC組之間是否存在差異，如病理分化、侵襲程度等；其次糞便隱血試驗作為CRC序貫篩查的重要環節，本研究未收集入選者的相關結果；最后，僅135例患者具有完整的SEPT9、五項腫瘤標志物資料，未能分析所有入組患者的資料。

綜上所述，外周血SEPT9基因甲基化檢測為無創性檢查，其檢出率與CRC病程進展呈正相關，在CRC診斷中具有較高的敏感性和特異性，但其對腺瘤的診斷價值有限。在人群篩查中聯合應用SEPT9基因甲基化和CEA檢測，有助于受試者進一步接受結腸鏡檢查，從而提高CRC的早期篩查率。