膿毒癥患者免疫紊亂中樹突細胞與T細胞分化及表型研究①

曲冰杰 郭劍穎 王宏偉

(北京懷柔醫院病理科，北京101400)

膿毒癥發病涉及感染、炎癥、免疫、凝血及組織損傷等諸多病理過程，其中抗炎狀態/免疫抑制引發的免疫功能障礙是造成膿毒癥發生的重要機制。最近研究顯示，樹突細胞(Dendritic cells,DCs)數量減少及功能低下在膿毒癥免疫抑制中發揮著重要作用[1]，但在膿毒癥免疫抑制中是否存在DCs的異常分化并影響T細胞功能仍未完全闡明。本研究以臨床膿毒癥患者為研究對象，研究膿毒癥患者外周血DCs的分化及免疫表型變化特點，進一步探討調節性DCs(Regulatory DCs，DCregs)誘導膿毒癥免疫功能障礙的病理學機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 收集重癥監護病房臨床確診的膿毒癥患者10例(男6例，女4例，平均年齡48±8.6歲)，健康對照組10例(男女各5例，平均年齡45±7.5歲)。膿毒癥組患者根據病程分為膿毒癥早期(1～2 d)和膿毒癥后期(7～8 d)兩個階段。

1.1.2標本收集 無菌操作抽取膿毒癥組及對照組靜脈血5 ml于EDTA-Na2抗凝管中，立即輕搖混勻，室溫保存，6 h內進行測定。

1.1.3試劑及儀器 鼠抗人單克隆抗體包括Lin-1-FITC、CD33-PE、HLA-DR-Percp、PD-L1-APC、CD123-PE、CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、PD-1-APC及同型對照、FACS 溶血素、紅細胞裂解液及BD-FACS Calibur流式細胞分析儀均購自美國BD公司。

1.2方法 流式細胞術檢測：各組患者取150 μl血液樣本加入適量肝素抗凝，DCs表型檢測時加入Lin-1-FITC、CD33-PE、CD123-PE、HLA-DR-Percp、PD-L1-APC抗體2～5 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，離心、洗滌后重懸細胞，如圖1A標記單個核細胞，并應用設門法分別標記Lin-單個核細胞、Lin-CD33+HLA-DR+、Lin-CD33+PD-L1+髓系DCs和Lin-CD123+HLA-DR+、Lin-CD123+PD-L1+類漿系DC(圖1B～F)；T細胞表型檢測時加入CD3-Percp、CD4-FITC、CD8-PE、PD-1-APC抗體2～5 μl，混勻后室溫避光孵育30 min，加入2 ml 的紅細胞裂解液，室溫避光孵育8 min，離心、洗滌后重懸細胞，如圖2應用設門法標記出CD4+(圖2A)和CD8+(圖2B)T細胞，CD4+PD-1+(圖2C)和CD8+PD-1+(圖2D)T細胞。……