microRNA-25通過HMGB1途徑降低缺氧/復(fù)氧H9C2心肌細胞纖維化①

劉啟方 黃 晶 田龍海 安亞平 岳 峰

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽550002)

心肌缺血再灌注損傷是心臟缺血后伴隨血流再通而發(fā)生的病理生理過程，研究證明缺血后的心肌重新恢復(fù)血流灌注會導(dǎo)致心肌細胞凋亡及心肌纖維化[1]。心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)是心肌組織病理性的細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)積聚，導(dǎo)致心肌僵硬，舒張或收縮功能下降，最終引起心力衰竭。它在多種心血管疾病中普遍存在，是心室重構(gòu)的主要表現(xiàn)[2，3]。miRNA-25作為在心臟中相對高表達的miRNA，參與心肌纖維化、心臟重構(gòu)、心力衰竭等許多病理生理的調(diào)控[4，5]。H9C2心肌細胞是來源于胚胎期心臟組織的細胞,與原代心肌細胞相比，H9C2細胞具有增殖分裂的能力，其電生理、細胞信號傳導(dǎo)通路及許多生物學(xué)活性與原代心肌細胞相似。本研究通過構(gòu)建高表達miR-25 H9C2穩(wěn)定細胞系，探討miR-25對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 H9C2心肌細胞株來自中國科學(xué)院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及HMGB1抗體購自Gibco公司，TIMP2、MMP2、CollagenⅠ、CollagenⅢ、Fibronectin、TGF-β、P-smad3及P-ERK1/2抗體購自Abcam公司；RIPA裂解液(強)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物有限公司。熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；穩(wěn)壓電泳儀(美國HealForce公司)；紫外可見分光光度計(上海spectrum公司)。

1.2方法

1.2.1H9C2細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在超凈臺中將保存的細胞懸液轉(zhuǎn)入5 ml配制好的DMEM培養(yǎng)基的離心管中。混勻后離心，去上清液，加入5 ml新的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。選取處于生長期的H9C2細胞作為轉(zhuǎn)染對象，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105ml-1，取6孔培養(yǎng)板,每孔分別接種2 ml細胞懸液，培養(yǎng)24 h后進行慢病毒感染。……