龍眼體胚發生過程HD-Zip全基因組與生物功能分析

張春渝，徐小萍，陳曉慧，張舒婷，張梓浩，陳裕坤，林玉玲，賴鐘雄

（福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建福州 350002）

HD-Zip家族基因是植物中特有的一類轉錄因子，屬于同源異型盒蛋白家族，是由一個高度保守的同源異型結構域（homeodomain，HD）與亮氨酸拉鏈結構域（LZ）構成。HD-Zip蛋白常作為二聚體與DNA結合，在此過程中HD與DNA特異性結合，LZ則作為二聚基序，通過此過程從而達到調控靶基因的表達。HD-Zip基因家族可以根據其蛋白結構特征、功能等的不同被分為4個不同的亞家族。每個亞家族都有自身的特點，HD-Zip I與HD-Zip II的蛋白結構域具有很高的同源性，二者結構中都有高度保守的HD與LZ結構域，但HD-Zip II結構域中還含有一個保守的半胱氨酸-脯氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-谷氨酸（CPSCE）結構域和一個N末端；除了具有HD-LZ結構域以外，HD-Zip III還具有一個START（類固醇敏感的脂質調節蛋白）結構域和SAD（START adjacent domain，SAD）結構域，以及MEKHLA（甲硫氨酸-谷氨酸-賴氨酸-組氨酸-亮氨酸-丙氨酸）結構域；HD-Zip IV與HD-Zip III結構較相似，但相比HD-Zip III缺少了MEKHLA結構域[1-2]。

目前已經在多個植物中發現了HD-Zip基因，如在擬南芥（Arabidopsis thaliana）以及楊樹（Populus trichocarpaT&G）中都有報道[3]。在HD-Zip基因家族中各亞家族的成員各司其職，其基因家族成員主要功能有參與果實與花的發育、光形態的構建、參與激素的調控等[4]。目前，對HD-Zip家族基因的分析主要集中于克隆分析或是對單個亞家族進行生物功能的分析。如在紫花苜蓿鹽誘導下克隆MsHB2發現此基因受到誘導產生的ABA的間接調控并參與ABA傳導的過程[5]；在大豆中也有對HD-Zip基因的克隆及分析[6]；在擬南芥中分析了HD-Zip I的功能，發現其參與ABA信號的調控[7]；當前已經對HD-Zip家族基因進行全基因組分析的有水稻、馬鈴薯、小麥、葡萄等[8-11]，但在無患子科龍眼屬龍眼中尚未見報道。

龍眼（Dimocarpus longanLour.）作為亞熱帶重要的果樹之一，其胚胎發育情況與其果實品質、坐果率以及產量息息相關，所以對龍眼胚胎的研究對于龍眼生產具有重要意義。目前對龍眼胚胎的發育已有了一定的研究進展，如研究AGO家族基因對龍眼胚性愈傷組織的作用；谷胱甘肽代謝相關基因在龍眼體胚發生過程中的作用[12-13]。且當前已經在多個植物中報道過HD-Zip基因家族的某些成員參與胚胎發育的調控。據報道，在擬南芥中由于HD-Zip III或KANADI基因受損時，其胚胎模式會受到嚴重影響[14]；AtHB1作為HD-Zip I亞家族的轉錄因子在植物色素相互作用因子1的下游起到促進下胚軸的生長作用[15]。由此猜測，龍眼HD-Zip基因家族成員也有可能參與胚胎生長發育與不同組織器官形態的構成。因此有必要對龍眼HD-Zip基因家族成員進行鑒定，以及分析其生物學功能，有利于進一步了解HD-Zip家族基因與龍眼生長的相關性，為龍眼品質的發展提供研究基礎。

該文通過對龍眼HD-Zip基因家族成員的鑒定、分類、蛋白結構域的分析、基因結構、系統進化樹的構建以及在不同體胚階段與不同組織器官中基因的表達來分析龍眼HD-Zip家族基因，有利于進一步了解其生物學功能，為后續研究提供一些基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗室構建的龍眼基因組數據庫（NCBI登錄號：BioProject PRJNA305337）、龍眼轉錄組數據庫（SRA050205）、于（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn）下載的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甜橙（Citrus sinensis）基因組HD-Zip家族的氨基酸序列。

1.2 方法

1.2.1HD-Zip基因家族成員鑒定。利用擬南芥與甜橙的基因組HD-Zip氨基酸序列為種子序列，與龍眼基因組數據庫進行同源比對，篩選注釋獲得25條龍眼HD-Zip候選序列。根據基因組注釋，采用DNAMAN軟件對HD-Zip的gDNA、CDS以及啟動子序列進行比對分析，初步確定龍眼HD-Zip家族成員。其中，Dlo_016699.2、Dlo_005643.1、Dlo_027079.2、Dlo_0181 82.1、Dlo_031302.1、Dlo_017332.1 這 6 個基因的 ID各自對應2個CDS與2個氨基酸序列，通過DNAMAN序列比對分析，發現他們各自的2個CDS與2個氨基酸序列完全重合，因此可視為同一條基因。再者，Dlo_026005.1基因的CDS不完全，缺少3端序列，通過PCR引物擴增之后，依舊沒有獲取到，故將其刪去。因此，初步確定龍眼HD-Zip基因家族的成員有18個。

1.2.2 進化樹的構建。采用MEGA5.05將下載好的擬南芥、甜橙氨基酸序列與篩選之后的龍眼HD-Zip氨基酸序列進行進化樹的構建。在構建過程中，手動刪除同源性相差較大的序列（其中Dlo_020289.1由于自身的氨基酸序列太短，無法參與進化樹的構建，故將其刪去）設置1 000次自展法系數為Bootstrap的重復檢驗，采用N-J鄰近法進行進化樹構建。采用同樣的方法對龍眼HD-Zip基因家族進行了單獨的系統進化分析。

1.2.3 HD-Zip蛋白質結構域分析。首先，通過Conserved Domains Database在線預測軟件對候選序列進行初步的蛋白質結構域分析；其次，采用phmmer seach|HMMERv 3.0對候選序列蛋白結構域作進一步分析；最后，通過MEME[16]在線軟件，對候選序列進行motif分析，然后使用TBtools對得到的motif結果進行繪制，以此對龍眼HD-Zip基因家族蛋白保守結構域進行更深入的分析。

1.2.4 HD-Zip蛋白質理化性質與基因結構分析。采用 GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）在線分析龍眼HD-Zip基因家族成員的基因結構，采用ExPASy對候選序列的氨基酸數目、蛋白分子量、等電點進行分析。

1.2.5HD-Zip基因家族不同體胚發生階段及不同組織器官特異表達分析。為了解HD-Zip基因家族成員在龍眼不同體胚發生階段與不同組織器官中的生物學功能，結合龍眼基因組數據庫提取的HD-Zip家族基因在不同體胚發生階段非胚性愈傷組織（Nonembryonic callus，NEC），不完全胚性緊實結構（Incomplete compact pro-embrogenic cultures，ICpEC），球形胚（Globular embryos，GE）和不同組織器官（幼果、種子、花、花蕾、葉、果肉、果皮、根、莖）中特異表達的FPKM值，采用TBtools對獲得的FPKM值進行聚類分析圖的制作。

2 結果與分析

2.1 HD-Zip家族基因鑒定及蛋白特性

采用“1.2.1”方法，獲得了18個龍眼HD-Zip家族基因。參考擬南芥與甜橙HD-Zip家族成員的命名方法，將其命名為HD-ZipI：DLHB1-1，DLHB1-2，DLHB1-3；HD-ZipII：DLHB2-1，DLHB2-2；HD-ZipIII：DLHB3-1，DLHB3-2，DLHB3-3，DLHB3-4；HD-ZipIV：DLHB4-1，DLHB4-2，DLHB4-3，DLHB4-4，DLHB4-5，DlHB4-6，DLHB4-7，DLHB4-8，DLHB4-9。

采用“1.2.4”方法得到了候選序列的蛋白理化性質，不難發現屬于同一亞家族的基因擁有相近的氨基酸數目和蛋白質分子量。HD-Zip I家族基因的氨基酸數目平均為235.7；HD-Zip II家族基因的氨基酸數目平均為171.5；HD-Zip III的氨基酸數目平均為822，HD-Zip IV的氨基酸數目平均為856.22，可以看出I、II亞家族基因之間的氨基酸數目較為相似，III、IV亞家族基因之間的氨基酸數目也較為相似?？赡苁且驗镮和II，III和IV亞家族之間的蛋白質結構較為相似。候選基因的等電點（IP）介于4.70～9.37，差異較大，可能是不同亞家族之間結構與功能的不同所致（表1）。

表1 龍眼HD-Zip基因家族蛋白質理化性質

2.2 HD-Zip基因結構及系統進化樹

首先大部分基因具有完整的基因結構，內含子與外顯子分隔排布，其中DLHB4-8含有最多的內含子，有24個，其次是第III亞家族的基因DLHB3-1、DLHB3-2、DLHB3-3、DLHB3-4含有較多的內含子，包含16～17個。第I、II亞家族的基因包含的內含子數目與其他亞家族相比較少。各基因長度之間存在明顯的差異，可能是因為基因功能的不同所致（圖1）。

為了進一步了解龍眼HD-Zip基因家族的生物學功能，基于擬南芥、甜橙的氨基酸序列，采用MEGA5.05對龍眼和擬南芥、甜橙進行系統進化樹的構建。參考擬南芥、甜橙中HD-Zip基因的分類，以及結合HD-Zip自身基因家族蛋白結構特征，采用CDD蛋白質結構域分析，將龍眼HD-Zip基因家族成員初步分為以下 4 類：HD-ZipI：DLHB1-1，DLHB1-2，DLHB1-3；HD-ZipII：DLHB2-1，DLHB2-2；HD-ZipIII：DLHB3-1，DLHB3-2，DLHB3-3，DLHB3-4；HD-ZipIV：DLHB4-1，DLHB4-2，DLHB4-3，DLHB4-4，DLHB4-5，DLHB4-6，DLHB4-7，DLHB4-8，DLHB4-9（圖 2）。

圖1 龍眼HD-Zip家族成員基因結構內含子外顯子分布

圖2 擬南芥、甜橙、龍眼 HD-Zip家族成員氨基酸序列系統進化分析

2.3 HD-Zip基因蛋白保守結構域

為了進一步研究龍眼HD-Zip基因家族的蛋白質保守結構域，在該次研究中，使用MEME在線軟件，搜索了30個motif（圖3）。不同基因包含不同的基序量，但同一亞家族的基因包含的基序量較為相近。其中motif 1，motif 3，motif 19在基因中出現的頻率最高，在14個基因中都出現過，說明這3個基序在龍眼HD-Zip基因家族中較為保守。結合InterPro分析可知，motif 1、motif 3同屬于同源異型域（homeodomain，HD），motif19屬于 START 區域。此外，筆者還發現，進化樹中同一小分支的基因具有相似的基序，表明其可能有相同的保守結構域與相類似的生物學功能。

圖3 龍眼HD-Zip基因家族系統進化樹構建（左）及基序預測（右）

2.4 HD-Zip家族基因組織特異表達

圖4 龍眼HD-Zip家族在不同體胚發生階段和不同組織器官中的特異表達

為了進一步研究龍眼HD-Zip家族基因在不同體胚發生階段和不同器官中的特異性表達，結合龍眼基因組數據庫注釋中不同體胚發生階段的和不同器官中的FPKM值，制作聚類分析圖（圖4）。分析可知，龍眼HD-Zip家族基因在不同體胚中的表達量不同，總體有7種表達模式。在NEC中上調表達而在其他階段下調表達的基因有（DLHB3-1、DLHB3-4、DLHB3-3、DLHB4-2）；在NEC中下調表達，在其他階段都上調表達的基因有DLHB4-1、DLHB4-4、DLHB2-1、DLHB4-5、DLHB4-6；在 NEC、ICpEC 中下調表達而在EC與GE中上調表達的基因有DLHB4-8、DLHB4-7；在 NEC、EC、ICpEC、GE 4 個階段都下調表 達 的 基 因 有DLHB1-3、DLHB1-1、DLHB1-2、DLHB4-9；DLHB3-2基因 NEC與 GE階段上調表達，在EC與ICPEC階段下調表達；DLHB2-2在EC階段下調表達，其他階段上調表達；DLHB4-3在GE階段下調表達，其他階段上調表達，總體來看，龍眼HD-Zip基因在不同體胚中的表達大多呈現下調的趨勢。

在不同組織器官中，HD-Zip家族基因成員也呈現出了不同的表達。其中有7個基因在所有的組織器官中都為下調表達（DLHB4-2、DLHB4-3、DLHB4-1、DLHB4-4、DLHB2-1、DLHB4-5、DLHB4-6）；DLHB1-2基因在幼果中顯著上調，其在其他組織中都表現為下調；在種子中有3個基因上調表達（DLHB1-1、DLHB1-3、DLHB4-7），這3個基因在其余某些組織中也有上調的趨勢；在花中有3個基因上調表達；在花蕾中DLHB4-9基因顯著上調表達，在花中也略微上調表達；在葉子中僅有2個基因上調表達，在果皮中也僅有2個基因（DLHB3-1、DLHB3-4）上調表達且上調表達都不顯著；在果肉中DLHB1-1、DLHB4-8上調表達；在根系中有8個基因上調表達，有6個基因上調表達顯著（DLHB3-1、DLHB3-3、DLHB3-4、DLHB3-2、DLHB1-1、DLHB1-3），可能大部分的基因成員參與根的發育；在莖中有5個基因上調表達，但僅有DLHB3-1基因上調表達顯著。總體來說龍眼HD-Zip基因在不同組織器官中的表達呈現下調的趨勢。

3 討論

3.1 HD-Zip家族基因參與體胚的形態建成

通過對龍眼HD-Zip基因家族在不同體胚階段的表達分析可知，龍眼HD-Zip基因家族在體胚發育不同階段的表達模式具有多樣性。首先在NEC階段有5個基因顯著上調顯著，其中有4個是第III亞家族的基因，由此推測龍眼HD-Zip III基因家族成員可能參與胚胎發育的調控，但在擬南芥中HD-Zip III中成員首先在球形胚中表達[17]，而龍眼HD-Zip III成員在球形胚中表達并不明顯，可能不同的物種之間同類基因也存在一定的差異；同時DLHB4-1、DLHB4-4、DLHB4-5、DLHB4-6、DLHB2-1這 5 個基因 在 EC、ICPEC、GE中全都呈現顯著的上調表達；且DLHB2-2在ICPEC與GE中及DLHB4-3在EC與ICPEC中都特異性表達。由此猜測，龍眼HD-Zip II與HD-Zip IV可能在胚胎發育過程中也發揮了重要作用。龍眼胚胎發育中胚胎的誘導與生長素的含量息息相關，可見參與生長素的調控就有可能進而參與龍眼的胚胎發育。此前就有報道在擬南芥中的HAT2影響生長素的應答[18]，且在油棕中已經有報道II類家族基因成員在早期胚胎中呈現高表達[19]。早前也在玉米中發現，玉米HD-Zip IV基因家族成員決定了玉米的胚胎的特定區域[20]。這些報道為龍眼HD-ZipII、HD-ZipIII、HD-ZipIV基因參與胚胎的發育提供了可能。

3.2 HD-Zip家族基因參與不同組織器官形態的構建首先在不同的組織器官中龍眼HD-Zip家族基

因在根中的上調表達最為明顯，說明HD-Zip中多數的基因成員可能參與了根的發育。此前HD-Zip中的一些成員就有被報道參與植物根的發育。如在擬南芥中HD-Zip III基因在側根的個體發育中發揮了作用[21]，豆類中的HB1作為HD-Zip I的一員參與根的發育和根系生長的調節[22]；其次，在幼果中DLHB1-2特異性表達，說明DLHB1-2（HD-Zip I）在幼果的形成中起到了重要的作用，研究發現HD-Zip II基因家族成員JAIBA有助于果實的形成[23]。而HD-Zip I與HD-Zip II同源性相近，可能也存在著類似的功能。總的來說，在不同的組織器官形態建成的過程中，龍眼HD-Zip家族基因成員呈現出多樣的表達模式。