基于ISSR-PCR分子標記的黑木耳遺傳多樣性分析

李 紅 ，張 敏 *，屈 麟 ，劉國麗 ，劉巖巖

（1.遼寧省農業科學院食用菌研究所，遼寧沈陽 110161；

2.沈陽工學院生命工程學院，遼寧沈陽 113122）

黑木耳（Auricularia auricula）是中國最早開始人工栽培的食用菌，具有非常重要的食藥用價值，是我國著名的“山珍”之一，享有“黑色瑰寶”、“素中之葷”之美譽。隨著人們對黑木耳消費需求的提高，我國黑木耳產業發展迅猛，但是菌種科學的研究幾乎處于空白。到目前為止，黑木耳栽培品種黑29、8808、黑威9、新科等多為野生種質直接馴化而來，基本上采用常規的組織分離法，雜交品種較少。因此，結合生產和市場的需求，黑木耳品種選育工作迫在眉睫[1]。選擇雜交親本是黑木耳雜交育種的關鍵，對黑木耳菌株進行有效的分類和親緣關系鑒定是黑木耳育種成功與否的重要因素。基于基因組廣泛存在SSR的特點，利用SSR本身設計引物，無需預先克隆和測序且通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，嚴謹度高，穩定性和可重復性好，廣泛用于食用菌系統發育、品種鑒定及遺傳育種研究[2]。該文應用ISSR-PCR分子標記的方法對黑木耳菌株遺傳多樣性進行分析，以期為黑木耳的分類鑒定及遺傳育種親本的選配提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株（表1）。

表1 供試菌株

1.1.2 培養基。PDB綜合培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蛋白胨3 g，水1 000 mL，pH自然。用于總DNA提取的菌絲培養。

1.1.3 試劑和儀器。ISSR-PCR反應所用的 Taq DNA Polymerase、dNTP、10×buffer購自北京鼎國昌盛公司，真菌提取試劑盒（omega）、DNA marker（DL2000）、引物購自 TaKaRa有限公司（大連），PCR儀為德國Biometra公司的Thermocycler。

1.1.4 引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的的ISSR引物序列，共計20條，由TaKaRa有限公司（大連）合成（表2）。

表2 20個引物序列

1.2 方法

1.2.1 菌絲體培養。將活化的菌絲切下0.5 cm2菌塊，接種于PDB綜合培養基，23℃搖床培養，轉數為150 r/min。將培養好的菌液用無菌水洗滌2次，用無菌濾紙吸干菌絲體表面的水分，-20℃保存備用。

1.2.2 總DNA提取及檢測。采用真菌提取試劑盒提取基因組總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

1.2.3 PCR反應及電泳。引物參照加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的的ISSR引物序列，由TaKaRa有限公司（大連）合成。PCR反應體系為20 μL：其中模板 DNA 1 uL（200 ng/uL），dNTPs 3 uL（2.5 mm），引物 1 μL（10 um），Taq DNA 聚合酶 0.4 uL（2.5 U/μL），10×buffer(含 Mg2+）2 μL，用 ddH2O 補至總體積 20 μL。擴增程序為：95℃預變性 5 min；95℃變性 30s；45～55℃退火 30 s（退火溫度因不同引物而定）；72℃延伸105 s；4℃保存。2～4步35個循環。PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，GelDoc-It型凝膠成像系統照相。

1.2.4 數據處理。電泳結果采取0/1賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現DNA片段的記為1，不出現的記為0，統計后輸入電腦，用聚類分析軟件 NTsys進行聚類分析，并計算遺傳相似度。

2 結果與分析

2.1 引物篩選

從20條ISSR引物中篩選出8條多態性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物，對22個供試菌株進行了ISSR-PCR擴增。8條引物共擴增出97條帶（圖1～4），其中多態性條帶為90條，多態位點百分率為92.8%。每條引物擴增出大約12條帶，DNA片段大小為250～2 000 bp。

圖1 引物P1對22個黑木耳菌株的ISSR-PCR擴增效果

圖2 引物P3對22個黑木耳菌株的ISSR-PCR擴增效果

圖3 引物P7對22個黑木耳菌株的ISSR-PCR擴增效果

圖4 引物P16對22個黑木耳菌株的ISSR-PCR擴增效果

2.2 基于ISSR分析結果構建樹狀圖

當遺傳相似系數為0.7時，供試菌株被聚類成6個類群（圖5）：第1類為長城1號、菊3；第2類為野生 1、野生 2、野生 3、黑優 1、MR10、888、豐產 7、神8-7、新科 10、鐵 1、春寶、海元、豐產王、889、黑威伴金；第3類為木29、黑威15；其他3類親緣關系較遠，分別為新科4、純黑山、918，遺傳相似系數達到0.8，單個菌株自成1類。

3 結論與討論

該文應用ISSR-PCR分子標記的方法對黑木耳菌株遺傳多樣性進行分析，從20條引物中篩選出8條多態性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物進行了ISSR-PCR擴增，結果顯示8條引物均能將供試菌株區分開，表明ISSR分子標記對黑木耳菌株遺傳多樣性分析是可行的。22個黑木耳菌株遺傳背景比較豐富，菌株聚類結果與菌株的地理分布有關。

雜交親本的選擇是雜交育種的關鍵，而親本的遺傳背景及其之間的親緣關系的確定則是選擇優良親本所必須的。由于以往親本的選擇以其地理位置、經濟性狀等進行收集，利用傳統的菌體形態、生長特性及生理生化反應特征加以分類和比較，受環境等因素的影響較大，難以對形態差異較小的種間和種內菌株加以鑒別，給雜交親本的選擇帶來很大困難。分子標記技術的迅猛發展給食用菌的品種鑒定和親緣關系的確定帶來新的活力，利用分子標記技術選擇親本可克服傳統方法的缺點，它所揭示的是DNA水平遺傳多樣性，受環境影響小，目前利用ITS、RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SCAR 等分子標記技術進行食用菌菌株鑒定、分析種質間的遺傳多樣性、菌株間的親緣關系等方面已有較多的報道。