MC4R基因敲除對雌性小鼠代謝和肝臟脂肪性病變的影響

陳小琳 陳 晨

MC4R是中樞調節能量穩態的關鍵受體之一。中樞MC4R與弓狀核(ACR)內起降低食欲作用的阿片促黑素細胞皮質素原(POMC)神經元合成、分泌的α-黑素細胞刺激激素(α-MSH)相結合，起著降低食欲和促進能量代謝的作用[1～3]。大量研究表明，Mc4r基因敲除雄性小鼠表現為多食、肥胖和高胰島素血癥[4,5]。肥胖和高胰島素血癥與女性生殖功能密切相關[6～8]。本研究旨在觀察Mc4r基因敲除對雌性小鼠食欲、體重、血糖、胰島素水平、糖耐量、胰島素敏感度、肝臟脂肪性病變的影響，為研究Mc4r基因敲除對雌性小鼠生殖功能影響提供研究基礎。

材料與方法

1.實驗動物：Mc4r-/-雌性小鼠由Mc4r+/-小鼠交配產生，并進行基因鑒定。所有實驗均在澳大利亞昆士蘭大學生物醫學科學院陳晨教授實驗室完成。6周齡小鼠兩只一籠飼養，12h光暗周期(光照6:30時～18:30時)，室溫22±2℃，小鼠自由取水、進食。

2.實驗觀察：每天測定小鼠進食量和體重。分別在8、12、16、20、26周齡測定空腹、餐后血糖，在8、12、16、20周齡測定空腹、餐后胰島素水平。

3.腹腔葡萄糖耐量實驗(glucose tolerance tests，GTT)[9]：20周齡，兩組小鼠分別行GTT。小鼠空腹12h，腹腔注射葡萄糖(2g/kg體重)，分別測定注射前及注射后15、30、60、90min末梢血糖。

4.腹腔胰島素耐量實驗(insulin tolerance tests，ITT)[9]：20周齡，兩組小鼠分別行ITT。小鼠空腹6h，腹腔注射胰島素(0.5U/kg體重)，分別測定注射前及注射后15、30、45min末梢血糖。

5.肝臟脂肪變性的觀察：取新鮮肝組織OCT包埋，冷凍切片(厚12μm)，分別快速HE染色和油紅染色，Aperio ScanScope XT病理掃描系統掃描成像。

結 果

1.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠攝食和體長的影響:MC4RKO雌性小鼠每日攝食量大于WTLM雌性小鼠，差異有統計學意義(P=0.000)，見圖1。16和28周齡MC4RKO雌性小鼠身長長于WTLM雌性小鼠(圖2)，差異有統計學意義(P=0.000)。

圖1 小鼠每日攝食量(g)

圖2 小鼠身長(cm)

2.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠體重和內臟脂肪的影響：MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠從8周齡開始體重之間比較，差異有統計學意義(P=0.000，圖3A)。16、28周齡MC4RKO雌性小鼠皮下脂肪(圖3B)、腹腔脂肪(圖3C)、腹股溝脂肪(圖3D)、卵巢脂肪(圖3E)、腎周脂肪(圖3F)均重于同齡WTLM雌性小鼠，差異有統計學意義(P=0.000)。28周齡MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠皮下脂肪、腹腔脂肪、腹股溝脂肪、卵巢脂肪、腎周脂肪亦均重于16周MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠，兩組間比較差異有統計學意義(P值分別為0.000、<0.01、<0.05)。

3.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠血糖和胰島素水平的影響：8周齡，MC4RKO雌性小鼠和WT LM雌性小鼠兩組之間空腹、餐后血糖和胰島素水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。12、16、20周齡MC4RKO雌性小鼠空腹(圖4A)、餐后血糖(圖4B)和空腹(圖4C)、餐后(圖4D)胰島素水平均高于WTLM雌性小鼠(P值分別為0.000、0.000，<0.01、<0.05)。26周齡，MC4RKO雌性小鼠空腹血糖高于WTLM雌性小鼠野，而餐后血糖兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

4.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感度的影響：20周齡MC4RKO雌性小鼠顯示葡萄糖耐量異常(圖5A)，葡萄糖曲線下面積(圖5B)大于WTLM雌性小鼠(P值分別為0.000、<0.05)。同時，與20周齡WTLM雌性小鼠比較，MC4RKO雌性小鼠顯示胰島素敏感度降低(圖5C、D，P值分別為<0.01、<0.05)。

5.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠肝臟重量的影響:16周齡和28周齡MC4RKO雌性小鼠肝臟重量均重于16周齡和28周齡WTLM雌性小鼠，兩組間比較差異有統計學意義(P=0.000),詳見圖6。

6.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠肝組織學和肝細胞脂肪性病變的影響：16周齡(圖7B)、28周齡(圖7D)MC4RKO雌性小鼠肝臟大體觀體積較16周齡(圖7A)、28周齡(圖7C)WTLM雌性小鼠肝臟體積明顯增大，且28周齡(圖7D)MC4RKO雌性小鼠肝臟質地較硬，色澤變黃。HE染色光鏡下觀察，16周齡(圖7E)和28周齡(圖7G)WTLM雌性小鼠肝臟組織結構完整、清晰，肝小葉正常，肝細胞呈多形、排列成肝索，呈放射狀分布。16周齡(圖7F)MC4RKO雌性小鼠肝臟HE染色光鏡下發現肝細胞體積增大，肝索排列稍紊亂，胞質中有脂滴空泡；28周齡(圖7H)MC4RKO雌性小鼠肝細胞體積變小，肝索排列紊亂，肝小葉結構不清晰，胞質中有大量脂滴空泡。油紅染色光鏡下觀察，16周齡(圖7I)、28周齡(圖7K)WTLM雌性小鼠肝細胞未見紅色脂滴，16周齡(圖7J)MC4RKO雌性小鼠肝細胞可見大量細小紅色脂滴，28周齡(圖7L)MC4RKO雌性小鼠肝細胞可見大量較大紅色脂滴。

圖3 小鼠體重和內臟脂肪含量
A.體重;B.皮下脂肪;C.腹腔脂肪;D.腹股溝脂肪;E.卵巢脂肪;F.腎周脂肪；*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000

圖4 小鼠血糖和胰島素水平
A.空腹血糖；B.餐后血糖；C.空腹胰島素；D.餐后胰島素；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

圖5 葡萄糖耐量和胰島素耐量
A.腹腔葡萄糖耐量試驗;B.葡糖糖曲線下面積;C.腹腔胰島素耐量試驗;D.相對葡萄糖曲線下面積；*P<0.05,**P<0.01，***P=0.000

圖6 小鼠肝臟重量

討 論

肥胖引起女性生殖內分泌紊亂是導致育齡女性不孕的主要原因。確切發病機制尚未闡明。到目前為止，還沒有一個廣泛公認的動物模型用于研究其發病機制、病程發展、臨床治療和預防。下丘腦是中樞調控能量代謝和生殖的關鍵部位。MC4R屬于G蛋白耦聯受體超家族(GPCRs)成員之一, 分布在大腦皮質、下丘腦、垂體、性腺，具有雌雄間差異[10,11]。黑皮質素4受體(MC4R)是下丘腦控制食欲和促進能量代謝的關鍵分子[12～14]。已有研究證實，Mc4r基因敲除的雄性小鼠表現為多食、肥胖和高胰島素血癥。本研究以MC4RKO雌性小鼠為研究對象，觀察MC4R基因敲除對雌性小鼠能量代謝和肝臟的影響。

圖7 小鼠肝臟組織學
A～D.大體標本；E～H.HE染色(×200);I～L.油紅染色(×200)

本研究結果顯示，MC4RKO雌性小鼠表現為多食、體長增加、肥胖，尤其是內臟脂肪增加。MC4RKO雌性小鼠在12周齡出現血糖、胰島素水平顯著升高。26周齡基因敲除小鼠和野生型小鼠兩組間餐后血糖比較，差異無統計學意義。推測分析可能與基因敲除小鼠此時已表現為嚴重肝臟脂肪性病變有關。20周齡MC4RKO雌性小鼠已顯示糖耐量異常和嚴重胰島素抵抗。MC4RKO雌性小鼠在16周齡時已出現肝臟腫大和脂肪性病變，28周齡時肝臟已顯示出重度脂肪肝和肝硬化。因而，MC4RKO雌性小鼠可以作為雌性肥胖動物模型進行代謝性疾病的動物實驗研究。

肥胖引起女性生殖內分泌紊亂的機制以及肥胖的表型復雜，一種動物模型不能解釋所有肥胖表型導致的機體功能異常。由于本實驗中MC4RKO雌性小鼠攝入的是普通動物飼料導致肥胖，該模型更適合用于因食欲亢進導致肥胖的動物模型研究。該動物模型是否存在生殖功能異常，何時出現生殖功能紊亂，與生殖相關的激素如何變化，還需要進一步研究。