兩種方法建立樹鼩骨質疏松模型的比較實驗研究

武羽潔 袁 鑫 角建林 吳 超 鄭 紅 唐 薇

骨質疏松癥(osteoporosis, OP)是一種由于骨量低下，骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病，其中患者多為絕經后女性，已被世界衛生組織(WHO)列為十大最嚴重疾病之一[1]。女性絕經后體內雌激素水平下降,骨量流失加速,導致骨轉換加快、骨組織退化以及骨密度的較低,大大提高女性骨質疏松的發生率,不僅嚴重影響患者的生活質量,還對患者的生命安全存在極大的安全隱患[2,3]。

樹鼩(tree shrew)是一種形似松鼠的雜食動物，廣泛分布于東南亞的大部分地區，包括印度和中國南部[4]。樹鼩在進化過程中處于食蟲目與靈長目之間，接近靈長類的小型哺乳動物，由于其具有體形小、腦體質量比高、易馴化飼養、繁殖周期短、壽命較長等特點，在生化代謝、生理機制、大體解剖和基因組等方面接近于人類，是潛在可能替代靈長類的一種新型、極具價值和科學研究需求的實驗動物[5]。WHO鼓勵用樹鼩代替日益瀕危的靈長目動物進行動物實驗。動物模型是開展OP科研工作的有效工具, 建立理想的動物模型對于探尋OP的發病機制以及研發治療OP的新方法和新藥物等具有重要意義[6]。

卵巢的功能主要是排卵及分泌性激素。參與生育功能及維持月經、對神經內分泌和全身的某些代謝也起到十分重要的調節作用，卵巢產生的雌激素在骨質代謝中也有重要作用。近年來研究表明,子宮不僅是一個受激素作用的靶器官, 而且還能分泌泌乳素、胰島素生長因子、松弛素、上皮因子、內皮素及細胞因子、酶等多種生物活性物質, 與卵巢、垂體進行精細的內分泌調節[7]。Waston等[8]進行嚴格實驗設計, 結果子宮切除患者盡管保留了雙側卵巢, 仍有明顯的骨密度下降。田杰等[9]研究不同術式子宮切除術對患者骨代謝影響時發現患者切除子宮后骨轉換加快, 骨吸收大于骨形成, 長期骨代謝處于負平衡狀態易導致繼發性的骨質疏松。上述研究表明，子宮和卵巢都是影響骨質量的重要因素。去卵巢大鼠模型是一種高轉換型OP模型，已被公認為“金標準”模型，但去卵巢法能否建立樹鼩OP模型以及效果如何，猶未可知[10]。本研究分析對比了去卵巢和去卵巢子宮兩種去勢方法建立雌性樹鼩OP動物模型的效果，為后續的研究工作提供一定的理論基礎。

材料與方法

1.實驗動物：45只滇西亞種樹鼩，雌性，體質量120±10g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，普通級。動物使用許可證號：SYXK(滇)2015-0002。

2.儀器與試劑：雙能X線骨密度儀(型號：Prodigy,美國GE公司)；電子天平(型號：YP2001N，上海精密科學儀有限公司)；3%戊巴比妥鈉(由昆明醫科大學實驗動物中心提供)。

3.分組：將45只雌性樹鼩分為3組，即正常組15只，去卵巢組15只，去卵巢子宮組15只。

4.建模：雌性樹鼩用3%戊巴比妥鈉(1ml/kg)麻醉后，分別在下腹部兩側各剪一個約1cm的開口，去卵巢組樹鼩切除雙側卵巢，去卵巢子宮組樹鼩切除雙側卵巢+子宮，在傷口處涂撒適量青霉素后縫合。造模期間的前3天，青霉素肌內注射2×105U/只，預防感染。

5.稱量樹鼩體質量：術后3、6、9個月，利用電子天平，稱量各組樹鼩體質量。

6.檢測樹鼩BMD、BMC：術后3、6、9個月，采用雙能X線骨密度儀，將麻醉的樹鼩水平置于平臺上，空氣校準后，分別對各組樹鼩進行全身性掃描，獲得雙能X線骨掃描圖像，采用小動物骨密度分析軟件，可獲得樹鼩全身的BMD及BMC。

結 果

1.體質量變化情況：3組樹鼩體質量隨時間變化情況詳見圖1，3組樹鼩體質量均逐漸增加，但去卵巢組及去卵巢子宮組體重增加幅度比正常組大。在第6個月時，去卵巢組以及去卵巢子宮組樹鼩體質量高于正常組樹鼩，差異有統計學意義(P<0.05)；在第9個月時，去卵巢子宮組樹鼩體質量高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組體質量變化情況
與正常組比較，*P<0.05

2.全身骨密度變化情況：在建模后第3個月時，去卵巢組及去卵巢子宮組樹鼩全身骨密度顯著低于正常組(P<0.01)；且去卵巢子宮組樹鼩全身骨密度低于去卵巢組，差異有統計學意義(P<0.05)。術后第6個月和第9個月，去卵巢組及去卵巢子宮組樹鼩全身骨密度顯著低于正常組(P<0.01)；且去卵巢子宮組樹鼩全身骨密度低于去卵巢組，差異有統計學意義(P<0.01)。在術后第6個月時，去卵巢組及去卵巢子宮組樹鼩骨密度下降率最大，分別為18.77%和26.65%，詳見表1和圖2。

表1 兩種去勢法對骨密度下降率的比較(%)

圖2 各組樹鼩全身骨密度變化情況
與正常組比較，*P<0.01；與去卵巢組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.全身骨礦鹽含量變化情況：去卵巢組與正常組樹鼩骨礦鹽含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；去卵巢子宮組樹鼩骨礦鹽含量在術后第6個月時顯著低于正常組和去卵巢組，差異有統計學意義(P<0.01)；術后第9個月時，各組樹鼩骨礦鹽含量比較，差異有統計學意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 各組樹鼩全身骨礦鹽含量變化情況
與正常組比較，*P<0.01；與去卵巢組比較，#P<0.01

討 論

骨質疏松癥累及多數老年人, 尤其是絕經后老年女性隨著年齡增長、卵巢功能衰竭, 雌激素水平降低, 骨量流失會更加嚴重[11]。嚴重的骨質疏松癥可出現自發性骨折，危及患者的生活質量。影響骨密度的原因很多，其中肥胖的因素越來越受到重視[12]。肥胖和骨質疏松都是機體常見慢性病。肥胖是機體脂肪含量過多或分布異常所造成的一種病態表現，世界衛生組織(WHO)將BMI>30kg/m2人群定義為肥胖。在中國隨著居民生活方式和飲食結構的改變，肥胖的流行率逐漸增高，至2010年我國肥胖人口已達1.2億，肥胖及其相關慢性疾病已成為我國當今重大的公共衛生問題[13]。女性絕經后，體內激素及神經內分泌環境波動較男性顯著，在特定時期易于出現體脂的沉積或再分布。主要是由于成年向老年過渡階段內分泌暫時紊亂、雌激素分泌減少而腎上腺皮質功能代償性亢進，糖皮質激素分泌增多而促進脂肪吸收和儲存。另一方面，隨著年齡的增長，機體各系統器官趨于衰退，細胞代謝緩慢，消耗能量也趨于減少，再加上運動量減少、營養過剩等從而造成肥胖[14]。本研究采用去卵巢法和去卵巢子宮法建立樹鼩OP模型，在建模第6個月去卵巢組和去卵巢子宮組樹鼩體質量顯著高于正常組樹鼩，與女性絕經后體質量增加結果一致。

根據世界衛生組織的提出的診斷骨質疏松癥的“金標準”是通過雙能X線骨密度儀測量BMD，當BMD值≤正常年輕人2.5個標準差(T值≤-2.5)時，即可確診為骨質疏松癥。BMD是直接對骨骼的量化診斷指標，常用于診斷骨質疏松癥，預測骨折風險和評定治療效果[15]。BMC是指被測量骨所含礦物質的總量，亦是反應骨質量的重要指標。本研究觀察到，去卵巢法和去卵巢子宮兩種去勢方法均能造成樹鼩BMD下降，且在術后第6個月出現最低谷。術后第6個月去卵巢組和去卵巢子宮組樹鼩BMD分別下降了18.77%、26.65%。去卵巢子宮組樹鼩BMC在第6個月顯著低于正常組和去卵巢組樹鼩。上述結果表明，采用去卵巢子宮法建立樹鼩OP模型效果更優。

綜上所述，采用去卵巢子宮手術法建立樹鼩骨質疏松動物模型更優，且術后的第6個月為建模的最佳時期。