血府逐瘀湯干預(yù)肺纖維化大鼠作用機制研究

王 祺，于雪峰，齊 越，劉小虎

0 引言

肺間質(zhì)纖維化是一種全球公認(rèn)的難治的呼吸系統(tǒng)疾病，近年來其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢。本課題組應(yīng)用活血化瘀代表方劑血府逐瘀湯加減治療肺纖維化，臨床觀察多年，療效較為滿意。本實驗采用血府逐瘀湯干預(yù)肺纖維化大鼠，通過觀測肺纖維化大鼠肺系數(shù)、肺組織肺泡炎和肺纖維化程度以及Smad-3、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloprotinase,MMP)-7蛋白表達情況的變化，進一步探討血府逐瘀湯干預(yù)肺纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇體重180～220 g SPF級健康雄性 Wistar 大鼠60只，合格證號：SCXK(遼) 2015-0001。血府逐瘀湯的組成及劑量遵照《醫(yī)林改錯》，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院中藥分析實驗室制備。試劑、藥物：注射用鹽酸博萊霉素(海正輝瑞制藥有限公司，批號：1603231);鹽酸潑尼松片(5 mg/片，天津力生制藥股份有限公司，批號：1707051)；蘇木素染液(貨號：BA-4041)、伊紅染液(貨號：BA-4024，水溶性)，粵珠食藥監(jiān)械；Masson三色染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號：16032311)、Smad-3免疫組化試劑盒(北京博奧森生物有限公司，批號：bs-3484R-50)、MMP-7免疫組化試劑盒(北京博奧森生物有限公司，批號：bs-0423R)。

1.2 方法

1.2.1 肺纖維化大鼠模型建立 依據(jù)王飛等[1]方法造模，手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作，向空白組大鼠氣管內(nèi)注入等容量生理鹽水。

1.2.2 分組及給藥 60只大鼠飼養(yǎng)于遼寧省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，適應(yīng)環(huán)境后隨機分為空白組(NS組)、模型組(BLM組)、潑尼松對照組(PC組)、血府逐瘀湯低劑量組(XL組)、血府逐瘀湯中劑量組(XM組)和血府逐瘀湯高劑量組(XH組)，共6組，每組大鼠10只。于造模第2天起，空白組、模型組每日1次灌服同等容積的生理鹽水；潑尼松對照組每日灌服1次相當(dāng)于 6.25 mg/kg 生藥的鹽酸潑尼松；血府逐瘀湯高、中、低治療組每日灌服1次相應(yīng)劑量的血府逐瘀湯，劑量分別為相當(dāng)于 14.04 g生藥/kg(20 ml/kg)、7.02 g生藥/kg(10 ml/kg)、3.51 g生藥/kg(5 ml/kg)。

1.2.3 標(biāo)本采集及方法 各組于給藥第14天稱重后處死大鼠(每組6只)。每組大鼠分別應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 ml/100 g)后活體取材，開胸將肺組織完整取出并分離,用濾紙將血液擦凈，稱取肺濕重，計算肺系數(shù)。

取右肺于預(yù)冷生理鹽水中快速洗去血液，剔除結(jié)締組織，放入10%福爾馬林中固定,常規(guī)石蠟包埋,行HE染色、Masson染色、Smad-3和MMP-7免疫組化染色。

1.2.4 指標(biāo)檢測及判定標(biāo)準(zhǔn) 實驗期間觀察各組大鼠一般狀況，計算肺系數(shù)[肺系數(shù)=肺濕重(g)/身體重量(kg)×100%]。病理切片行HE染色、Masson染色，依據(jù) Szapiel 等[2]方法，于光鏡下觀察病理組織學(xué)變化，評價各組大鼠肺組織肺泡炎程度及肺纖維化程度；行Smad-3、MMP-7免疫組化染色，圖片采用Image J軟件進行陽性細(xì)胞計數(shù)分析，計算陽性細(xì)胞表達率(陽性細(xì)胞占比)，陽性細(xì)胞表達率越高，表示反應(yīng)越強。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況 空白組大鼠狀態(tài)良好，神態(tài)正常，身體活動靈活，呼吸平穩(wěn)，毛色純白，皮毛光滑潤澤，攝食飲水好，體重逐漸增加。模型組大鼠可見精神萎靡，喜倦臥，呼吸急促，皮毛無光澤，攝食飲水明顯減少，體重增加緩慢，明顯低于同期各給藥組大鼠。潑尼松對照組、血府逐瘀湯各治療組大鼠狀態(tài)較好，活動較靈活，呼吸平穩(wěn)，皮毛光澤度較好，攝食飲水較好，體重較同期模型組增加明顯。提示血府逐瘀湯各治療組和潑尼松對照組大鼠的一般狀況得到改善。

2.2 肉眼觀察 空白組大鼠雙肺無異常，呈粉紅色，表面光滑、飽滿，彈性好。模型組大鼠雙肺呈暗紅色，有點狀出血點，體積縮小、彈性較差，部分肺葉呈灰白色，表面凹凸不平。各給藥組與模型組病變接近，程度較模型組稍輕。

2.3 各組大鼠肺系數(shù)、肺泡炎、肺纖維化程度 ①大鼠給藥第14天，空白組與模型組比較，肺系數(shù)、肺泡炎、肺纖維化均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。②給藥第14天，各給藥組大鼠肺系數(shù)與模型組比較均有不同程度的下降；對照組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血府逐瘀湯低、中、高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血府逐瘀湯組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。③給藥第14天，各組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞。各給藥組與模型組比較，肺泡炎和肺纖維化程度均有不同程度的改善。肺泡炎評分：對照組、血府逐瘀湯高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；纖維化評分：對照組、血府逐瘀湯高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血府逐瘀湯低、中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。各給藥組肺泡炎、纖維化評分與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 第14天血府逐瘀湯對大鼠肺系數(shù)、肺泡炎、肺纖維化的影響(n=6)

注：與BLM組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖1 第14天各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE，40×)

圖2 第14天各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(Masson，40×)

2.4 各組大鼠Smad-3蛋白表達 給藥第14天，與空白組比較，各組Smad-3蛋白表達均呈上升趨勢，潑尼松對照組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，模型組及血府逐瘀湯低、中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。②與模型組比較，其余各組均有不同程度蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。③血府逐瘀湯各組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。

2.5 各組大鼠MMP-7蛋白表達 ①與空白組比較，模型組及血府逐瘀湯中、高劑量組大鼠給藥第14天 MMP-7蛋白表達顯著升高(P<0.01)，對照組、血府逐瘀湯低劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②給藥第14天，各給藥組與模型組比較，均有不同程度的蛋白表達降低；對照組、血府逐瘀湯高劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，血府逐瘀湯低、中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。血府逐瘀湯各組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖4。

表2 第14天血府逐瘀湯對大鼠Smad-3、MMP-7蛋白表達的影響(n=6)

注：與BLM組比較，*P<0.05，**P<0.01；與NS比較，#P<0.05；##P<0.01

圖3 第14天各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(Smad-3，400×)

圖4 第14天各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(MMP-7，400×)

3 討論

肺間質(zhì)纖維化是全球公認(rèn)的呼吸系統(tǒng)疾病中的難治病，是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂最終導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化為特征的一種疾病。

血府逐瘀湯為活血化瘀法代表方劑，出自清朝王清任編著的《醫(yī)林改錯》。血府逐瘀湯由桃仁、紅花、川芎、赤芍、當(dāng)歸、生地、黃芪、丹參等藥物組成[3]。其中丹參可以通過抑制肺纖維化大鼠TGF-β1/Smads信號途徑發(fā)揮抗纖維化的作用[4]；川芎嗪可以通過減輕肺纖維化大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的氧化損傷達到防治肺纖維化的效果[5]；赤芍可以通過TGF-β1和Smad-3/4 信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮抗纖維化作用[6-7]；藺興遙等[8]通過觀察黃芪黃酮與紅芪黃酮對肺間質(zhì)纖維化大鼠肺功能的影響，發(fā)現(xiàn)黃芪黃酮具有抑制大鼠肺間質(zhì)纖維化的作用。血府逐瘀湯中包含有逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的有效藥物和成分[9]；對肺纖維化模型動物的氧自由基損傷有不同程度的干預(yù)作用，并通過降低血清HA、肺組織HYP、膠原蛋白含量及提高彈性纖維含量改善其細(xì)胞外基質(zhì)代謝[10]；可預(yù)防肺纖維化，縮小病變范圍，改善患者生活質(zhì)量，改善臨床癥狀[11]等。

MMP是一類蛋白水解酶，主要功能為降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。MMP-7是MMPs家族中最小的成員之一，對于纖維連接蛋白、層黏連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)均有較強的降解作用[12]。研究表明，肺纖維化的主要病理表現(xiàn)為ECM重塑。因此，當(dāng)體內(nèi)MMP-7的表達出現(xiàn)異常下降時，其對于ECM的降解作用亦大大減弱，使ECM出現(xiàn)異常增多，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。由此可知，增加體內(nèi)MMP-7蛋白的表達，對于降解ECM，從而改善肺纖維化具有重要意義。

Smad-3位于細(xì)胞胞漿內(nèi)，屬于信號傳導(dǎo)分子。病理狀態(tài)下，活化后的受體與Smad-3結(jié)合，使其磷酸化后形成三聚體，隨后作用于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，促進EMT的生成和沉積，加速肺纖維化的形成。Sriram等[13]發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠經(jīng)博來霉素誘導(dǎo)制成肺纖維化模型后，Smad-3的表達在促進ECM沉積、形成肺纖維化的過程中具有重要作用。另外，彭艷芳等[14]在應(yīng)用肺纖維化大鼠進行試驗時發(fā)現(xiàn)，降低大鼠體內(nèi)Smad-3的過度表達，可減少大鼠體內(nèi)ECM沉積，抑制肺纖維化進一步發(fā)展。

本研究表明，血府逐瘀湯可以降低肺纖維化大鼠肺系數(shù)、肺組織肺泡炎和肺纖維化程度，抑制Smad-3和MMP-7蛋白表達，但其與潑尼松對照組比較以及血府逐瘀湯各劑量組組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示其可能通過抑制Smad-3和MMP-7蛋白表達來降低肺纖維化程度。