升陽益胃湯對胃癌前病變模型大鼠NF-κB表達及微血管密度的影響*

董曉峰，張 弢，周語平，李雪燕，劉光煒，張 超，陳開兵

(1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一。早期胃癌的臨床癥狀隱匿性較高、我國胃鏡的普查率相對較低等因素使大部分胃癌患者就診時已處中晚期，而目前尚無針對性的治療方案，因此，胃癌前病變(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)的治療成為干預和防治胃癌、降低胃癌死亡率的重要方法和手段。升陽益胃湯出自李東垣的《脾胃論》與《內外傷辨惑論》，由黃芪、半夏、人參、炙甘草、獨治、防風、白芍等藥物組成，具有益氣升陽、清熱除濕的作用。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)[1]是一種具有特定序列的多效轉錄因子，參與多種炎癥、凋亡、免疫過程，在胃癌的發生、發展中扮有重要角色。本課題組前期研究[2-5]證明，升陽益胃湯可以通過調節免疫應答、改善炎癥反應等途徑達到防治慢性萎縮性胃炎的目的。本實驗通過免疫組化法和實時熒光定量PCR檢測法觀察升陽益胃湯對PLGC模型大鼠NF-κB蛋白與基因表達的影響，采用免疫組化法檢測CD34的表達情況檢測大鼠MVD值的變化，探討其防治PLGC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級Wistar大鼠96只，雌雄各半，體質量(200±20)g，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。實驗動物合格證號為：SCXK(甘)2015-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

升陽益胃湯處方組成：黃芪、半夏、人參、炙甘草片、獨活、防風、白芍等。藥物均由甘肅中醫藥大學附屬醫院中藥房提供。維酶素片，0.2 g/片，新鄉恒久遠藥業有限公司產品，批號20170108；鹽酸雷尼替丁膠囊，0.15 g/粒，常州蘭陵制藥有限公司產品，批號20161215；甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)溶液，東京化成工業株式會社產品，批號NH8JH-QD；二甲基亞砜(DMSO)，北京索萊寶有限公司產品，批號521C0318； NF-κB Monoclonal Antibody與Anti-CD34 Rabbit Polyclonal Antibody，均為ImmunoWay公司產品，批號分別為B1101，20161204；熒光定量試劑盒，美國普洛麥格公司產品，批號0000238439；RNA 提取試劑盒，Promega公司產品，批號0000108522。XYJ80-2離心機，東莞市塘廈駿越機電設備廠產品；DF110型電子分析天平，常熟衡器工業公司產品；HH-4數顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市友聯儀器研究所產品；S1000TM反轉錄儀、Benchmark Plus酶聯免疫檢測儀、CFX96TM Optics Module PCR儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、Chemi DOC XRS+凝膠成像分析系統，均為美國BIO-RAD公司產品；BX51/BX52型顯微鏡，日本Olympus公司產品。

1.3 藥物的配制

以DMSO為溶劑充分溶解MNNG溶液，再加入去離子水配置為質量分數10 g/L的母液，放入 4 ℃冰箱避光保存。成人體質量以70 kg為標準，按照實驗動物學大鼠質量折算公式：體質量大鼠日服藥量=人日服藥量(70 kg)×0.018×5。據此，高劑量組大鼠的灌胃量應為2.66 g/mL，將升陽益胃湯中藥煎煮之后濃縮為此質量分數的濃縮液以備使用，中、低劑量藥液以去離子水稀釋后即得。按上述公式，維酶素懸浮液的質量分數為0.027 g/mL。

1.4 動物分組與模型的建立

將96只大鼠按隨機數字表法隨機分為正常對照組、模型對照組、維酶素組及升陽益胃湯高、中、低劑量組6組。除正常對照組外，其余各組大鼠避光自由飲用質量分數為150 mg/L的MNNG溶液(以MNNG母液稀釋)。將雷尼替丁溶于60 ℃的質量分數為150 g/L濃鹽水中配置成質量分數為2.25 g/L的雷尼替丁懸浮液。按大鼠體質量灌胃，灌胃體積為10 μL/g。連續造模6周，通過病理切片來驗證PLGC模型復制成功與否。

1.5 給藥方法

確認模型復制成功后，維酶素組給予質量分數0.027 g/mL的維酶素懸浮液灌胃，升陽益胃湯高、中、低劑量組分別以質量分數2.66，1.33，0.66 g/mL升陽益胃湯灌胃，均以10 μL/g 體質量灌胃，連續給藥45 d。正常對照組和模型對照組不做灌胃處理。

1.6 檢測指標

各組大鼠于末次給藥后，禁食不禁水24 h；以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，處死；快速取出大鼠胃黏膜組織，以生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干；一部分胃黏膜組織以多聚甲醛固定以備免疫組化檢查，另一部分組織快速放入-80 ℃冰箱凍存以備實時熒光定量PCR檢測。

1.6.1 NF-κB、CD34表達

采用免疫組化法檢測。對已經用多聚甲醛固定的胃黏膜組織進行常規的石蠟包埋，切片后，在脫蠟二甲苯溶液與不同體積分數的酒精中行脫蠟與水化操作；用檸檬酸鈉熱修復，并用3%過氧化氫孵育10 min，PBS液沖洗3次；滴加與二抗同源的動物血清進行封閉；按照SP試劑盒說明書所示分別滴加抗體并用DAB顯色，直到最終在鏡下觀察到棕黃色顆粒終止反應；分別進行蘇木素復染、梯度酒精、二甲苯透明、封片。各組NF-κB免疫組化切片在40倍鏡下隨機采10個視野，采用圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0分析棕黃色顆粒的平均光密度值(MOD)；CD34免疫組化切片則在40倍鏡下隨機取10個視野，用圖像分析軟件分析單位視野中棕黃色的顆粒得微血管密度(MVD)值。

1.6.2 胃黏膜NF-κB mRNA的表達

采用實時熒光定量PCR檢測。先提取胃黏膜組織RNA。胃竇組織總RNA制備方法如下：稱取大鼠胃竇黏膜組織50 mg并置于研缽中，加1 mL Trizol研磨均勻后冰上靜置 5 min，4 ℃、1 200 r/min離心5 min；移入離心管冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿震蕩，4 ℃、1 200 r/min離心15 min，取上清液移至離心管并加0.5 mL異丙醇震蕩，冰上孵育10 min，4 ℃、1 200 r/min離心10 min，棄上清液保留RNA沉淀物，向沉淀物中加1 mL體積分數為750 ml/L乙醇，震蕩后4 ℃、1 200 r/min離心10 min，再棄上清液后室溫靜置干燥，加50 μL DEPC處理水溶解RNA。其OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，經總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測符合純度要求。反轉錄合成模板cDNA：于0.5 mL去酶管中加入總RNA 5μg、Random Primer 1μL、15×OligodT 1 μL，再加Nuclease-Free Water至10 μL；于70 ℃變性5 min后冰上靜置5 min，再按步驟加入反轉錄各試劑，反應混合物總體積為20 μL，短暫離心后25 ℃溫浴5 min，42 ℃反應60 min，再于70 ℃、15 min滅活處理，所得單鏈cDNA放置于-20 ℃備用。

引物設計：從NCBI基因庫中查尋目標基因ID及序列。NF-κB上游引物序列為5′-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3′，下游引物為5′-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3′，擴增片段長度為150 bp；β-Actin上游引物序列為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物序列為5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，擴增長度為150 bp。以上引物均由大連TaKaRa公司設計合成。實時熒光定量PCR以β-actin為內參基因，相同模板相同基因設3復孔、6次平行實驗，得到各擴增反應的CT值。反應體系據GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒說明書配制。反應參數：預變性95 ℃、1 min，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，循環45次，終末延伸72 ℃、30 s。反應結束后由PCR分析儀采集目的基因(P16、P53)和內參基因(β-Actin)的CT值，并計算△CT=CT目的-CT內參，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組，最后各組再與對照組間進行2-△△CT計算，得出相對表達量。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 大鼠脫落情況

造模、判斷模型成功，以及給藥過程中均有大鼠死亡。最終各組動物數量如下：正常對照組14只，模型對照組10只，維酶素組12只，升陽益胃湯高、中、低劑量組分別為13，12，13只。

2.2 各組大鼠一般情況對比

正常對照組大鼠反應靈敏，飲食、體質量正常，皮毛光澤，精神狀態較好，無明顯扎堆現象，大便呈顆粒狀，墊料異味不明顯。模型對照組大鼠飲食減少，體質量增長緩慢，皮毛枯槁，反應遲鈍，易受驚嚇，扎堆現象明顯，大便不成形，墊料異味較重。與模型對照組對比，各藥物組大鼠狀態有所改善，飲食恢復，精神狀態好轉，大便恢復至顆粒狀。

2.3 各組大鼠胃黏膜MVD對比

與正常對照組大鼠對比，模型對照組大鼠胃黏膜微血管密度值減少，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組大鼠對比，各藥物組大鼠胃黏膜微血管密度值升高，差別有統計學意義(P<0.05)。見圖1與表1。

圖

1

各組大鼠胃黏膜CD34表達對比(免疫組化法，×40)

分組nMVD值/個正常對照組1435.75±2.500模型對照組1012.75±1.708?維酶素組1219.25±1.258#升陽益胃湯高劑量組1326.75±2.062#升陽益胃湯中劑量組1224.50±3.512#升陽益胃湯低劑量組1315.75±2.500#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠胃黏膜NF-κB表達對比

與正常對照組大鼠對比，模型對照組大鼠胃黏膜NF-κB增加，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組大鼠對比，各藥物組大鼠胃黏膜NF-κB蛋白表達量降低，差別有統計學意義(P<0.05)。見圖2與表2。

圖2各組大鼠胃黏膜NF-κB表達對比(免疫組化法，×40)

分組nMOD值正常對照組140.258±0.004模型對照組100.369±0.005?維酶素組120.322±0.006#升陽益胃湯高劑量組130.274±0.008#升陽益胃湯中劑量組120.300±0.007#升陽益胃湯低劑量組130.261±0.012#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.5 各組大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表達對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表達量升高，差別有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組對比，除升陽益胃湯低劑量組外，其余各藥物組大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表達量降低，差別有統計學意義(P<0.05)。見表3。

分組nNF-κB正常對照組141.00±0.00模型對照組103.01±0.06?維酶素組122.59±0.14#升陽益胃湯高劑量組131.09±0.05#升陽益胃湯中劑量組121.25±0.14#升陽益胃湯低劑量組132.95±0.09

注：與正常對照組比，*P<0.05；與模型對照組比，#P<0.05。

3 討 論

中醫學無胃癌前病變這一病名，近代醫家根據臨床表現將其歸屬于“痞滿”“嘈雜”等范疇。王道坤教授根據正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌(腸型)的發病過程，將其稱為“胃痞重癥”。現代醫家對于PLGC的病因病機認識各有側重。導師周語平根據PLGC的臨床表現認為其發病多由以脾虛為本、痰濕熱毒壅滯所致，臨床多以升陽益胃湯加減治療，并取得了較好的療效。升陽益胃湯中黃芪補中益氣，升陽固表；半夏、人參、甘草片仿大半夏湯通補胃陽，配以防風、白芍、羌活、獨活、橘皮、茯苓、澤瀉、白術祛風除濕，配以少量柴胡升舉陽氣，佐以少量黃連厚腸胃燥濕止泄。諸藥合用，共奏益氣升陽、清熱除濕之效。

本研究通過以血管內皮生成因子CD34為標記物進行免疫組化檢測，以檢測胃黏膜局部毛細血管數量，同時以SP免疫組化法與實時熒光定量PCR法檢測了NF-κB基因與蛋白表達水平的變化。結果顯示：與正常對照組對比，模型對照組大鼠MVD值顯著降低，NF-κB基因與蛋白的表達明顯升高，提示以MNNG為基礎的復合造模法可能通過介導炎癥反應，影響胃黏膜局部的血液循環狀態，限制胃黏膜局部營養的供應來源，致使腺體萎縮、細胞結構異型，從而達到復制PLGC模型的目的。與正常對照組對比，各藥物組大鼠MVD值均升高，NF-κB蛋白與基因的表達水平均降低，提示升陽益胃湯可以通過改善胃黏膜局部的炎癥反應，調節細胞增殖與凋亡失衡，修復胃黏膜局部血液循環狀態，改善胃黏膜病理狀態，從而達到干預PLGC進展、預防癌變的目的。