胃饑餓素在老年阿爾茨海默病患者炎癥因子調控中的途徑和作用探討

黃澈

阿爾茨海默病(AD)是老年群體常見的導致癡呆的神經系統退行性疾病之一。有研究顯示，全世界AD患者總數不低于0.38億，預計到2050年，AD患者總數將達到1.15億[1]。從病理學來說，AD主要病理改變為神經斑，伴有神經纖維纏繞和神經元細胞丟失。目前，有關AD的發病機制尚不明確，淀粉樣β-蛋白(Aβ)毒性假說是幾種主流假說中占主導地位的學說(其他還包括膽堿能神經元假說、Tau蛋白假說和自由基損傷假說等)。Aβ毒性假說認為：Aβ具有神經毒性，能改變患者體內炎癥因子表達水平，這些炎癥因子透過血腦屏障后將導致中樞神經元損傷，引起AD發病[2]。Toll樣受體4(TLR4)在人體內被認為是與炎癥反應關系密切的信號轉導通路之一，在免疫過程中發揮重要的炎癥調節作用。胃饑餓素(Ghrelin)是近年來新進發現的內源性腦腸肽之一，可發揮炎癥抑制作用[3]。然而，在AD患者體內是否存在二者之間調節失衡，相關研究較少。因此，本研究旨在探討Ghrelin在老年AD患者炎癥因子調控中的途徑和作用?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2013—2018年收治的老年AD患者173例，診斷參照《神經病學》相關標準[4]。入組條件：①年齡≥65歲。②臨床癡呆評定量表(CDR)評分≥1.0分。③無重要臟器功能障礙。④未應用免疫抑制劑或者免疫刺激劑。⑤無免疫系統疾病。⑥無感染性疾病。⑦履行充分告知義務后自愿參與本研究[5]。此外，選擇同期于我院進行體檢的老年健康人142例作為對照組。兩組人員性別、年齡、血壓、血脂、血糖等基線數據差異均無統計學意義(P＞0.05)。具有可比性(表1)。

表1 兩組人員各項基線資料比較()

表1 兩組人員各項基線資料比較()

注：1 mmHg＝0.133 kPa

組別 例數 性別年齡/ 收縮壓/ 舒張壓/ 三酰甘油/ 總膽固醇/ 空腹血糖/男 女 歲 mmHg mmHg (mmol·L-1) (mmol·L-1) (mmol·L-1)觀察組 173 77 96 73.10±6.38 146.68±7.49 89.36±6.03 3.37±0.21 4.51±0.59 5.69±0.57對照組 142 68 74 72.49±6.47 144.23±8.11 88.42±5.97 3.29±0.19 4.53±0.61 5.71±0.59 t/χ2值 0.358 0.471 0.322 0.517 0.091 0.144 0.233 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

1.2 檢測方法

1.2.1 血液標本采集 于晨起、空腹、靜息狀態下，抽取外周肘靜脈血15 mL，等分為3份分裝，每份5 mL。其中1份全血用于TLR4表達水平檢測，2份分離血清后用于Ghrelin和炎癥因子水平檢測。血清分離方法：室溫條件下，以3 000 r/min速度離心10 min；之后以一次性吸管抽取上層血清，于-80 ℃深凍冰箱保存待測[6]。

1.2.2 Ghrelin水平測定 以外周血清(5 mL外周血分離所得)作為檢測標本，加入抑肽酶處理。之后以酶聯免疫吸附法(ELISA)測定其中?；头酋；疓hrelin總水平，操作過程參照試劑盒說明[7]。

1.2.3 TLR4陽性率測定 以外周血5 mL作為檢測標本。首先，以CD14磁珠分選裝置分離其中的單個核細胞，調整細胞濃度為5×105/mL。以10%小牛血RPMI 1640培養液常規培養后，加入500 μL破膜劑固定，避光孵育30 min后以Perm/Wash緩沖液重新懸浮。選取懸浮細胞液100 μL，加入10 μL鼠抗人TLR4抗體。避光孵育30 min后，以磷酸鹽緩沖液洗滌3次并重新懸浮。之后采用流式細胞術進行測定，TLR4陽性細胞比率由軟件自動計算生成[8]。

1.2.4 炎癥水平測定 本研究選擇腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和C反應蛋白(CRP)作為炎癥水評估指標。以外周血清(5 mL外周血分離所得)作為檢測標本，使用全自動化學發光分析儀測定上述炎癥因子水平，操作過程參照各試劑盒說明[9]。

1.3 研究方法 比較觀察組和對照組Ghrelin、TLR4陽性率和TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平。以CDR評分[10]作為依據，分為輕度癡呆亞組76例(CDR 1.0分)、中度癡呆亞組53例(CDR 2.0分)和重度癡呆亞組44例(CDR 1.0分)；比較不同亞組間各觀察指標差異，并進行相關性分析。

1.4 統計分析 以EpiData 2.3軟件建立數據庫，以SPSS 21.0作為統計分析工具，計數資料以()表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；相關性分析采用Spearman等級相關分析法，檢驗水準統一設定為α＝0.05。

2 結果

2.1 兩組人員Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較(表2) 觀察組Ghrelin水平低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；而TLR4陽性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 不同AD亞組Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較(表3～4) 隨著AD病情加重，Ghrelin水平呈逐漸下降趨勢，組間差異有統計學意義(P＜0.05)；而TLR4陽性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP水平呈逐漸增高趨勢，組間差異有統計學意義(P＜0.05)。相關性分析顯示，Ghrelin與TLR4陽性率、TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP均呈負相關關系(P＜0.05)；TLR4陽性率與TNF-α、IL-6、IL-1β 和CRP均呈正相關系(P＜0.05)。

表2 兩組人員Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較()

表2 兩組人員Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較()

組別 例數 Ghrelin/(ng·mL-1) TLR4陽性率/% TNF-α/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) CRP/(mg·L-1)對照組 142 23.95±5.21 49.37±7.25 4.16±0.94 3.94±0.81 9.34±2.11 18.52±4.37觀察組 173 9.54±2.16 81.26±9.36 13.27±4.35 17.51±4.91 24.37±5.10 33.66±6.79 t值 4.289 3.452 3.767 6.317 3.139 3.664 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 不同AD亞組Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較()

表3 不同AD亞組Ghrelin、TLR4陽性率和炎癥水平比較()

組別 例數 Ghrelin/(ng·mL-1) TLR4陽性率/% TNF-α/(pg·mL-1) IL-6/(pg·mL-1) IL-1β/(pg·mL-1) CRP/(mg·L-1)輕度癡呆亞組 76 14.37±4.15 72.24±9.27 8.33±2.15 11.35±2.14 16.38±3.90 25.11±4.70中度癡呆亞組 53 9.06±3.11 80.52±10.15 13.83±4.37 18.33±3.69 22.51±4.71 30.54±6.02重度癡呆亞組 44 6.42±1.57 93.64±12.33 19.44±5.20 26.33±5.31 31.44±6.79 39.47±7.19 F值 7.981 8.864 8.153 8.679 9.031 10.257 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表4 各觀察指標相關性分析結果

3 討論

AD是一種神經系統退行性疾病，自然病程呈進行性發展。AD患者多在發展中國家，且數量以每20年增加1倍的速度增長[11]。目前，AD發病機制尚未完全明確，占主導地位的Aβ學說認為，Aβ為不溶解的具有神經毒性的蛋白纖維，可聚集于神經斑的中心區域，加速神經元細胞死亡；而且Aβ可刺激機體釋放一些具有強烈神經毒性的炎性蛋白，上調炎癥因子水平導致損傷，而且這一炎癥損傷無法被血腦屏障所阻擋[12]。

Ghrelin是新進發現的一種內源性腦腸肽，含26～28個氨基酸殘基，由胃底細胞分泌。正常情況下，Ghrelin可在酰基化后透過血腦屏障，在炎癥免疫應答過程中發揮保護作用，可以減少小膠質細胞炎性增生，延緩神經元細胞死亡[13]。Toll樣受體家族(TLRs)是人體內重要的免疫蛋白分子家族，參與非特異性免疫，也是起著連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁的作用。TLR是單個的跨膜非催化性蛋白質，可以識別來源于微生物的具有保守結構的分子。其中，TLR4是TLRs最早被發現的成員之一，可激活下游信號分子引起酶學級聯反應，導致細胞損傷[14]。然而，目前Ghrelin是否可以通過TLR4通路影響炎癥活化過程并不清楚。

本研究中，我們旨在對Ghrelin和TLR4途徑的關系及其下游發揮炎癥作用的因子進行探討。結果顯示，與健康人相比AD患者Ghrelin水平較低，而TLR4陽性率較高。這說明在AD患者體內，發揮炎癥保護作用的Ghrelin水平較低；而TLR4炎癥調節通路被激活，導致下游包括TNF-α、IL-6、IL-1β和CRP在內的炎癥因子過度釋放。而在進一步亞組分析中我們發現，隨著AD病情的加重，Ghrelin水平進一步下降，而TLR4陽性率進一步升高，與之伴隨的是更高的炎癥水平。這說明AD患者體內炎癥和抗炎因素的失衡會隨著自然病程的進展而惡化，后續相關性分析結果也提供佐證，這與葉玉蘭[15]的研究結果基本一致。

綜上所述，我們認為老年AD患者體內存在炎癥和抗炎因素失衡，即Ghrelin可能通過TLR4途徑調控下游炎癥因子的失訪，而且這一失衡會隨著自然病程的進展而加重。