RIPK4、β-catenin和P-gp在骨肉瘤中的表達及臨床意義

梁爽

骨肉瘤為骨關節常見惡性腫瘤，近年來隨著臨床研究的不斷深入，人們發現蛋白激酶(RIPK4)、β-連環蛋白(β-catenin) 和P-糖蛋白(P-gp)等表達與疾病的發生、進展、是否轉移等方面有密切關聯[1-2]，為進一步明確上述基因在骨肉瘤中的表達及意義，筆者選取我院收治的60例患者進行研究分析及長期隨訪，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取自2012年3月至2014年1月在我院接受手術治療的40例骨肉瘤患者作為研究對象，均經病理活檢證實。其中男25例，女15例；年齡7～65歲，平均年齡(40.29±3.33)歲；Enneking分期[3]：Ⅰ/ⅡA期為17例，ⅡB/Ⅲ期23例；其中成纖維細胞型6例，成軟骨細胞型10例，成骨細胞型21例，混合型3例；其中發生肺轉移患者15例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 使用試劑 RIPK4 羊多克隆抗體由美國Abcam公司提供，兔抗人β-catenin多克隆抗體由英國Abcam公司提供，鼠抗人P-gp單克隆抗體由北京中山生物技術公司提供，S-P免疫組化試劑盒由福州邁新生物技術開發公司提供。

1.2.2 方法 取骨肉瘤組織標本，常規石蠟包埋組織標本，切片、脫蠟，免疫組化染色嚴格按照試劑盒說明書進行：水化切片后，在RIPK4和β-catenin檢測時，首先采用pH 6.0檸檬酸鈉0.01 mol/L進行抗原修復，在對P-gp進行檢測時首先采用pH 8.0的EDTA 0.5 mol/L進行微波抗原修復，加入3%過氧化氫溶液內孵育10 min，加入稀釋過的山羊抗人RIPK4多克隆抗體(1∶200)、兔抗人β-catenin多克隆抗體(1∶200)及鼠抗人P-gp單克隆抗體(1∶40)，4 ℃室溫下放置一夜；室溫放置10 min后，以0.01 M PBS洗滌3次；加入二抗，于37 ℃溫度下放置10 min，0.01 M PBS再次洗滌3次。DBA顯色，蘇木素對比染色，脫水透明并進行封固。PBS作為陰性對照。

1.3 判定標準 RIPK4、β-catenin陽性[4]：細胞膜和(或)細胞質內有棕黃色顆粒。每張切片中隨機取10個高倍視野，取100個細胞，依照陽性細胞占據比例以及染色強度制定評價標準。β-catenin陽性結果判定[5]：從細胞質、細胞膜以及細胞核等方面對細胞內β-catenin分布情況進行判斷，細胞膜表達缺失或減弱、異位表達均為陽性表達。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件分析數據，計數資料采用率表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Enneking 不同分期及肺轉移者RIPK4、β-catenin、P-gp陽性表達比較(表1) ⅡB/Ⅲ組骨肉瘤組織內RIPK4、β-catenin、P-gp陽性表達率明顯高于Ⅰ/ⅡA組，差異有統計學意義(P＜0.05)。合并肺轉移骨肉瘤組織的RIPK4、β-catenin、P-gp陽性表達均明顯高于無肺轉移者，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 不同病理分型與RIPK4、β-catenin、P-gp 陽性表達比較(表2) 不同病理分型骨肉瘤組織的RIPK4、β-catenin 和 P-gp陽性表達比較差異無統計學意義，二者無相關性(P＞0.05)。

表1 Enneking不同分期及肺轉移者RIPK4、β-catenin、P-gp陽性表達比較[n(%)]

表2 不同病理分型與RIPK4、β-catenin、P-gp陽性表達比較[n(%)]

2.3 生存時間與RIPK4、β-catenin和P-gp陽性表達 RIPK4、β-catenin和P-gp陽性表達組患者平均生存時間為(3.19±0.68)年，RIPK4、β-catenin和P-gp陰性表達組患者平均生存時間為(4.70±0.56)年，兩組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 骨肉瘤患者生存時間相關影響因素多因素分析(表3) 多因素回歸分析顯示，Enneking分期、RIPK4及P-gp陽性表達與患者生存時間具有正相關性(P＜0.05)。

表3 骨肉瘤患者生存時間相關影響因素多因素分析

3 討論

近年來，隨著臨床對骨肉瘤研究的不斷深入，特異性標志物在疾病的診斷、病情監測中的價值逐漸被發現。COX-2、MMP-9等為臨床用于腫瘤的診斷指標，然而其特異性及敏感性均較低，難以滿足臨床診斷的要求[6]，因此需找新的標志物并通過聯合檢測來提高診斷特異性已經成為臨床共識。RIPK4屬于蘇/絲氨酸蛋白激酶家族，在皮膚癌、卵巢癌及肝癌等多種惡性腫瘤中有強陽性表達，且在腫瘤的發生、侵襲以及轉移中有所參與。本次研究結果顯示，骨肉瘤組織內可見RIPK4強表達，且ⅡB/Ⅲ期、合并肺轉移者RIPK4陽性表達率明顯更高。黃炎等[7]在研究中發現，腫瘤的發生、發展為多基因共同參與的復雜過程，其中β-catenin有著重要參與，主要通過結合型、游離型兩種方式存在，當Wnt細胞通路激活后，細胞質β-catenin降解受到抑制，大量積聚在細胞質內，并經細胞核與T細胞因子/淋巴增強因子相結合，啟動MDR基因與靶基因C-myc等轉錄，誘導腫瘤的發生。β-catenin與腫瘤分期、是否合并肺轉移等具有密切相關性，且其可以預測預后，提示β-catenin在骨肉瘤的發生與發展中可能有所參與。P-gp 為ABC轉運蛋白家族的主要成員，為MDR1基因編碼的跨膜糖蛋白，有研究發現骨肉瘤患者化療效果不佳與其作用機制有著密切關系[8-9]，P-gp可水解產生能量，并將抗腫瘤藥物主動泵出細胞外，從而導致腫瘤細胞內藥物濃度大大降低，引起耐藥現象的出現。本次研究中，P-gp陽性表達高，且與Enneking分期以及肺部轉移有關，白璐等[10]研究發現，隨著腫瘤分期的增高，P-gp的陽性表達率呈現出正相關表現。

本次研究對患者進行5年的隨訪，RIPK4、β-catenin和P-gp陰性表達組患者的生存時間明顯長于陽性表達組患者(P＜0.05)，隨著RIPK4、β-catenin和P-gp表達的增強，則腫瘤體積增加且隨著血液轉移至肺部，導致患者死亡，因此有學者主張對上述特異性因子進行抑制，從而改善預后[11-13]。動物實驗顯示[14-15]將RIPK4 shRNA轉染入大鼠體內，從而對PIPK4基因的表達進行抑制，結果發現隨著時間延長，大鼠體內腫瘤體積呈現出縮小趨勢，由此可見通過對特異性因子表達進行抑制，能夠為骨肉瘤預后的逆轉提供新的治療靶點。

綜上所述，RIPK4、β-catenin和P-gp基因與腫瘤的發生、侵襲以及轉移之間有著密切關系，能夠預測結局，為臨床治療提供新的思路。