血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態性及其表達率與動脈粥樣硬化性急性腦梗死的關系

陳云 周元林 蔣輝華 柯紹發 陳葆國 朱敏 韓文勝

腦梗死是由各種原因致局部腦組織血液供應障礙而發生的缺血、缺氧性壞死，具有高發病率、高致殘率，嚴重危害人類健康；其最常見的病因是動脈粥樣硬化。血小板作為動脈斑塊、血栓形成過程中不可或缺的成分，參與動脈粥樣硬化發生、血栓栓塞形成的各個環節。活化狀態下的血小板膜糖蛋白CD41/CD61復合物能表達多種血小板受體功能，與纖維蛋白原、血管性血友病因子、纖維連接蛋白等粘連性蛋白結合形成異二聚體，使血小板黏附、聚集，在動脈粥樣硬化性急性腦梗死的發生中起著關鍵作用[1]。本研究通過檢測162例動脈粥樣硬化性急性腦梗死患者和131例健康體檢者血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態性及其表達率，探討血小板膜糖蛋白CD41/CD61基因多態性及其表達率與動脈粥樣硬化性急性腦梗死的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2015年6月至2016年9月在溫州醫科大學附屬臺州醫院神經內科住院的首次腦梗死患者162例（腦梗死組），其中男82例，女80例；年齡41～85（63.39±10.79）歲。所有患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》診斷標準[2]，且全部經頭顱MRI確診為急性腦梗死，其病因為動脈粥樣硬化。選擇同期在溫州醫科大學附屬臺州醫院體檢中心體檢的無各類心腦血管及外周血管病史的健康者131例作為對照組，其中男 63 例，女 68 例；年齡 36～84（60.20±9.38）歲。兩組性別、年齡、吸煙史、飲酒史、TG、TC、HDL、LDL、糖化血紅蛋白、超敏C反應蛋白（hs-CRP）比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），但兩組高血壓史、2型糖尿病史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、同型半胱氨酸、ESR水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。排除標準：腦出血、顱內感染、急性心肌梗死、心房顫動、心臟瓣膜病、嚴重肝腎功能不全、自身免疫性疾病、風濕性疾病、感染性疾病、血液系統疾病、慢性炎癥性疾病及結核、腫瘤患者。所有研究對象均為臺州地區漢族人，彼此間無血緣關系，既往無卒中史。本研究經溫州醫科大學附屬臺州醫院醫學倫理委員會批準通過，所有研究對象均知情同意。

表1 兩組對象一般臨床資料比較

1.2 主要試劑和儀器 外周血基因組DNA抽提試劑盒（型號：S20060081 GK4001-100，上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR產物純化試劑盒（型號：E5200S 100reaction，美國NEB公司）。核酸定量分析儀（型號：752N，上海精科儀器有限公司）；流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；ABI 3730XL測序儀（美國ABI公司）。

1.3 標本采集 抽取所有受試者清晨空腹靜脈血4ml，以乙二胺四乙酸二鈉抗凝，用于基因組DNA抽提，保存于-86℃冰箱中凍存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 DNA提取 采用外周血基因組DNA抽提試劑盒從白細胞中提取基因組DNA，核酸定量分析儀測定DNA濃度和吸光度（A260/A280）比值，將比值位于1.7～2.0者作為PCR擴增模板。

1.4.2 引物設計及PCR擴增 選用DNAStar軟件設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。CD41上游引物：5′-CTCAAGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAAGAC-3′，下游引物：5′-CTCACTACGAGAACTGGATCCTGAAGCCTC-3′；CD61 上游引物：5′-CTGCAGGAGGTAGAGAGTCGCCATAG-3′，下游引物：5′-CTCTCTAGACCTC-CACCTTGTGCTCT-3′。PCR反應體系為上下游引物各0.5μl，2×MasterMix 12.5μl，DNA 模板 1μl，加雙蒸水至總體積25μl。PCR反應條件：預變性95℃ 2min，變性94℃ 45s，退火 56℃ 30s，延伸 72℃ 45s，共 35 個循環。吸取擴增產物5μl，于瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析PCR產物特異性。

1.4.3 序列分析 將PCR擴增產物寄往上海桑尼生物科技有限公司，采用ABI 3730XL測序儀進行基因測序分析。

1.5 CD41、CD61表達率檢測 采取的靜脈血標本在6h之內使用流式細胞儀檢測CD41、CD61表達率。

1.6 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。采用Pearson雙側χ2檢驗評估Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。基因計數法計算兩組基因型和等位基因頻率，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子數）（/2×受檢人數）。計數資料組間比較采用χ2檢驗。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗。采用多因素logistic回歸分析發生動脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 腦梗死組和對照組CD41基因型分布經卡方擬合優度檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡（腦梗死組：χ2=0.460，P=0.794；對照組：χ2=0.310，P=0.857），表明研究對象具有群體代表性。CD61基因型均為基因TT型（未突變型）。

2.2 兩組CD41多態性基因型和等位基因頻率分布 兩組CD41多態性基因型和等位基因頻率比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。以TT基因型作為參考，分析動脈粥樣硬化性急性腦梗死的發病風險，結果顯示TG+GG基因型與動脈粥樣硬化性急性腦梗死發病風險增加有關（OR=1.719，95%CI：1.059～2.788，P＜0.05）。以T等位基因作為參考，分析動脈粥樣硬化性急性腦梗死的發病風險，結果顯示G等位基因與動脈粥樣硬化性急性腦梗死發病風險增加有關（OR=1.517，95%CI：1.079～2.120，P＜0.05）。

表2 兩組CD41多態性基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

2.3 兩組CD41和CD61表達率比較 腦梗死組CD41表達率為（98.68±1.49）%，高于對照組的（97.76±5.53）%，差異有統計學意義（t=4.950，P=0.028）。腦梗死組CD61表達率為（98.41±1.88）%，對照組為（98.28±2.61）%，兩組比較差異無統計學意義（t=0.156，P=0.694）。

2.4 腦梗死組TG+GG基因型和TT基因型CD41表達率比較 腦梗死組TG+GG基因型CD41表達率為（98.22±4.24）%，高于 TT 基因型的（95.41±3.88）%，差異有統計學意義（t=2.107，P=0.038）。

2.5 多因素logistic回歸分析發生動脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險因素 將兩組對象性別、年齡、高血壓史、2型糖尿病史、吸煙史、飲酒史、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、TG、TC、HDL、LDL、同型半胱氨酸、糖化血紅蛋白、ESR、hs-CRP和CD41多態性基因型等資料納入多因素logistic回歸方程，結果顯示高血壓史、收縮壓、空腹血糖、同型半胱氨酸、TG+GG基因型是發生動脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險因素（均P＜0.05），見表3。

表3 多因素logistic回歸分析發生動脈粥樣硬化性急性腦梗死的危險因素

3 討論

血小板膜糖蛋白CD41/CD61是細胞黏附受體整合素家族成員之一，其與纖維蛋白原、膠原或血管性血友病因子等相結合可促使血小板黏附、聚集，故在血栓性疾病的形成中起著關鍵作用[3]。CD41和CD61基因位于17q21-q22。CD41基因全長約17.2kb，含有30個外顯子和29個內含子，分子量約154kDa。CD61基因全長約46.0kb，屬單拷貝基因，含14個外顯子和13個內含子，分子量約95kDa。CD41基因位于CD61基因3′端，兩個基因相距不足360kb。在未被激活的血小板中，CD41和CD61分開分布于血小板膜表面，在誘導劑作用后，兩者相互作用形成GPⅡb/Ⅲa復合物，成為凝血因子的受體，凝血因子結合在活化的血小板上，在Ca2+參與下實現聚集反應。CD41/CD61這種作用為血小板聚集的最終環節[4-5]。

研究表明血小板膜糖蛋白與腦血栓形成密切相關，其種類很多，較重要的有 CD41、CD42a、CD42b、CD61。CD41與CD61在膜上結合形成血小板中含量最多、也是最主要的黏附受體，是多種因素引起血小板聚集、血栓形成的最終通道，可直接反映血小板的活化狀態[6-9]。流式細胞儀測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種手段。使用流式細胞儀測定活化血小板是一種快捷而靈敏的方法，對血栓性疾病有重要的診斷價值。本研究結果顯示，腦梗死組CD41表達率明顯高于對照組，差異有統計學意義，表明血小板的活化促進了動脈粥樣硬化性急性腦梗死的病理生理過程。研究顯示，隨著血小板活化程度的增強，血栓進展速度加快，導致腦梗死病情加重，早期CD41的血清含量升高[6-7]。因此，CD41可作為腦血管病發生、發展及病情變化的觀察指標。研究表明CD41基因多態性與腦梗死發生相關[8-9]。也有研究表明CD41基因多態性與年輕人和年輕白人婦女的動脈粥樣硬化性急性腦梗死相關[10-11]。本研究結果與此一致。臨床上抑制血小板功能的藥物被廣泛應用于降低動脈粥樣硬化患者發生動脈閉塞的風險。血小板膜糖蛋白CD41/CD61拮抗劑通過抑制血小板膜表面的CD41和CD61與纖維蛋白原、膠原或血管性血友病因子相互作用，從而抑制血小板聚集及血栓形成，這是血小板橋接必不可少的。研究表明CD41/CD61拮抗劑可以改善急性腦梗死患者的臨床結局和降低缺血性腦卒中腦出血的危險性[12]。本研究結果顯示在一般臨床資料如性別、年齡、血脂、hs-CRP、飲酒史等匹配的情況下，腦梗死組和對照組CD41多態性基因型和等位基因頻率比較差異均有統計學意義，而多因素logistic回歸分析表明TG+GG基因型的OR值遠大于1，表明TG+GG基因型是動脈粥樣硬化性急性腦梗死的獨立危險因素，G等位基因是動脈粥樣硬化性急性腦梗死的遺傳易感基因。本研究結果對于動脈粥樣硬化性急性腦梗死的預防研究具有重要意義。

當然，本研究也存在一些局限性：首先，檢測到CD61基因型均為TT基因型（未突變型），有待進一步探尋新的突變位點；其次，本研究未分析不同基因型對腦梗死患者的預后和治療效果的影響。這些問題有待于后續的研究中進一步改進、解決。