卡非佐米對大鼠類風濕性關節炎的治療作用及機制研究

楊洋 張夢芹 周小小 劉炬 蔡攀 胥正鋒

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜增生、關節及關節周圍組織損害為特點的自身免疫性疾病[1]。RA患者關節破壞呈進行性、不可逆性并累及全身多處小關節，重者勞動力喪失，并嚴重影響生活質量。RA發病機制目前仍未完全闡明，炎癥反應在RA發展中起重要作用[2]。RA患者炎癥滑膜能高表達Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）并激活 Toll樣受體 2（Toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體 3（Toll-like receptor 3，TLR3）及 TLR4信號通路，TLR2 及 TLR4可與其下游銜接蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）結合，進一步強化炎癥反應[3]。研究表明特異性TLR4拮抗劑能夠通過抑制TLR4信號通路阻斷免疫性關節炎小鼠的炎癥反應，減輕RA患者的臨床表現和病理學改變，因此可作為治療RA的潛在藥物靶點。研究顯示蛋白酶體抑制劑能夠抑制RA患者NF-κB誘導細胞因子釋放及誘導活化T細胞凋亡[4]。卡非佐米（carfilzomib，CFZ）為二代蛋白酶體抑制劑，相比于一代蛋白酶體抑制劑具有抗多發性骨髓瘤的高效性和低毒性[5]。CFZ能夠通過破壞RANKL誘導的NF-κB活化，有效抑制破骨細胞分化和形成[6]。但CFZ能否治療RA目前尚不清楚。因此本研究采用不同劑量CFZ治療佐劑誘導關節炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠，觀察療效，并探究其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 適齡SPF級雄性SD大鼠35只（SCXK，#2013-0006，上海杰思捷公司），體重（180±5）g。所有大鼠均飼養于上海分子與細胞生物學研究中心SPF級動物實驗室，維持室溫22～25℃，相對濕度65%～75%，自由攝食水，模擬正常晝夜規律，每日光照12h。

1.2 試劑和儀器 CFZ購自加拿大Onyx Pharmaceuticals公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；抗-誘導型氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體、抗-環氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）抗體購自美國Boster公司；抗兔IgG H&L購自英國Abcam公司；Trizol試劑盒、EDTA緩沖液購自美國Thermo Fisher Scientifc公司；硝酸纖維膜購自上海天能科技有限公司；HRP羊抗鼠IgG及HRP羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術有限公司；Nanodrop 2000分光光度計購自美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統購自美國Eastern Kodak公司。

1.3 實驗分組、造模及給藥 采用抽簽法將35只大鼠分為預治療組、同時治療組、低劑量治療組（1.0mg/kg）、中劑量治療組（1.5mg/kg）、高劑量治療組（2.0mg/kg）、模型對照組和空白對照組7組，每組5只。造模方法：在SD大鼠右后足底皮下注射0.1ml完全弗氏佐劑[7]，1周后采用上述方式注射不完全弗氏佐劑強化免疫，2周后造模成功。預治療組：從實驗第1天開始每隔2d腹腔內注射1.5mg/kg CFZ（溶解于 0.5ml DMSO溶液），持續 2周，注射時間為實驗開始后的第1、4、7、10和13天；在第14天開始造模，2周后終止。同時治療組：實驗第1天開始造模同時腹腔內注射1.5mg/kg CFZ（溶解于0.5ml DMSO溶液），CFZ注射時間為實驗開始后的第1、4、7、10和13天。低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組：在SD大鼠造模成功后第1天即實驗開始后第15天每隔2d腹腔內注射不同劑量（1.0、1.5和2.0mg/kg）CFZ（均溶解于0.5ml DMSO溶液），注射時間為實驗開始后的第 15、18、21、24和27天。模型對照組：造模成功后每隔2d腹腔內注射0.5ml DMSO溶液，注射時間為實驗開始的第15、18、21、24和27天。空白對照組：未接受任何處理的健康SD大鼠。

1.4 大鼠患足觀察 每隔2d觀察大鼠肢體并記錄關節病變程度。采用5分法關節炎指數（arthritis index，AI）評估大鼠RA病情。評分標準如下：0分，肢體關節無明顯影響；1分，小趾關節輕度腫脹；2分，小趾關節及足部腫脹；3分，踝關節以下腫脹；4分，包括踝關節在內的全足腫脹。

1.5 標本提取

1.5.1 滑膜細胞分離及培養 實驗第28天處死各組大鼠，無菌條件下取踝關節滑膜組織，Ⅷ型膠原酶（1mg/ml）消化至少2h后采用100μm濾網過濾。在IMDM培養液中（含 10%FBS、0.05μg/ml慶大霉素和 2.5μg/ml兩性霉素B）中培養3～5d，隔天換液。細胞融合后胰酶消化，1:3傳代。

1.5.2 踝關節切片 取大鼠踝關節標本固定于10%甲醛中，予 10%EDTA脫鈣 7d，石蠟包埋，5～7μm 沿縱軸切片。

1.6 iNOS和COX-2表達水平檢測 采用免疫組化法。大鼠踝關節切片置于65℃恒溫箱30min，二甲苯脫蠟，乙醇清洗。加熱EDTA緩沖液（1∶10稀釋）至沸騰，將切片放入裝有EDTA緩沖液的修復缸中，在100℃下煮沸持續30min，冷卻至室溫。然后，將切片用抗原浸泡在1×PBS緩沖液中數分鐘，用PBST緩沖液（1×PBS+0.1%Tween20）洗滌3次，每次5min。內源性過氧化物酶用3%的雙氧水阻斷5min，然后用一抗（抗-iNOS抗體、抗-COX-2抗體）分別孵育踝關節切片進行免疫組化。再進行二抗（抗兔 IgG H&L）重吸收反應后，用PBST緩沖液沖洗玻片3次，每次5min。用DAB染色液避光染色5min，洗滌后染色終止。使用光學顯微鏡對圖像進行采集和分析。使用Image J 1.8.0分析積分光密度值（IOD）。IOD=觀測圖片中所有陽性染色點的光密度之和。

1.7 破骨細胞檢測 采用TRAP染色。將大鼠踝關節切片脫蠟同1.6。脫蠟后切片置于含0.1%TRAP混合液中37℃溫育1h。清洗后甲基綠復染5min，晾干，中性凝膠封閉。含有≥3個細胞核TRAP染色陽性的細胞為破骨細胞并在倒置相差熒光顯微鏡（×100和×200）下計數破骨細胞。顯微鏡下拍照后使用Image J 1.8.0分析IOD值。IOD=觀測圖片中所有TRAP染色陽性點的光密度之和。

1.8TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。應用Trizol試劑盒提取滑膜細胞總RNA并測定濃度，逆轉錄合成cDNA。以GAPDH作為內參，GAPDH 上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；TLR2上游引物：5′-CTACCAGATGCCTCCCTCTTACC-3′，下游引物：5′-GTGCTTGCTGCTCCTGAGTG-3′；TLR4 上游引物：5′-CACAGACTTGCGGGTTCTACATC-3′，下游引物：5′-AGTTCATAGGGTTCAGGGACAGG-3′；MyD88 上游引物：5′-AAGGAATGTGACTTCCAGACCA-3′；下游引物：5′-GGAATTCAGTCGCTTCTGTTGGA-3′。反應條件為先行 95℃ 30s，然后 95℃ 5s，60℃ 30s，95℃ 15s，55℃ 30s，95℃ 15s循環45次。使用Nanodrop 2000分光光度計檢測TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表達水平，使用 2-ΔΔCT法分析結果。

1.9 TLR2、TLR4、NF-κB、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及MyD88蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。使用裂解酶和苯甲基磺酰氟充分裂解滑膜細胞，完全裂解后離心，取上清液進行蛋白定量分析。使用10%SDSPAGE分離蛋白并分別轉移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉1h，所得的膜使用一抗（抗TLR2抗體、抗TLR4抗體、抗 NF-κB 抗體、抗 p-NF-κB 抗體、抗 MyD88抗體和抗GAPDH抗體）在4℃條件下孵育過夜。第2天再用二抗（HRP羊抗兔 IgG）在室溫下將膜孵育2h，然后在膜上滴加適量ECL顯影液，最后使用凝膠成像系統觀察并拍照分析。

1.10 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AIA大鼠后足變化 造模后28d拍攝后足變化典型圖片顯示AIA大鼠足踝部各關節出現明顯腫脹，AI指數達到4分，見圖1。分析各組大鼠后足AI發現，模型對照組、預治療組、同時治療組及低、中、高劑量治療組大鼠AI在實驗結束時均有所下降。與模型對照組比較，預治療組、同時治療組及低、中、高劑量治療組AI均明顯降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），其中高劑量治療組降低最明顯，見圖2。

圖1 AIA大鼠后足變化典型圖片

圖2 各組大鼠后足AI變化曲線

2.2 各組大鼠iNOS和COX-2表達水平比較 與空白對照組比較，模型對照組踝關節切片iNOS和COX-2表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型對照組比較，預治療組、同時治療組及不同劑量治療組iNOS和COX-2表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

2.3 各組破骨細胞數及IOD值比較 與空白對照組比較，模型對照組破骨細胞數及IOD值均明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型對照組比較，中、高劑量治療組破骨細胞數及IOD值均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；但低劑量治療組、預治療組和同時治療組與模型對照組破骨細胞數及IOD值比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠iNOS和COX-2表達水平比較

表2 各組大鼠破骨細胞數及IOD值比較

2.4 各組大鼠滑膜細胞TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達水平比較 與空白對照組比較，模型對照組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型對照組比較，中劑量治療組和預治療組MyD88 mRNA表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），但兩組TLR2和TLR4 mRNA表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；高劑量治療組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；同時治療組TLR2和TLR4 mRNA表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），但兩組MyD88表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）；低劑量治療組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達水平與模型對照組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠滑膜細胞TLR2、RLT4和MyD88 mRNA表達水平比較（與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對照組比較，△P＜0.01）

2.5 不同劑量CFZ對Toll樣受體（TLRs）/MyD88/NF-κB信號通路影響 低、中、高劑量CFZ均可明顯抑制TLR2、TLR4和 NF-κB蛋白表達，中、高劑量CFZ可明顯抑制p-NF-κB蛋白表達，僅在高劑量治療組中可觀察到MyD88蛋白表達抑制，見圖4。

圖4 不同劑量CFZ作用后TLRs/MyD88/NF-κB信號通路各蛋白表達的電泳圖

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，好發于中年女性，其病理學特點為慢性滑膜炎、滑膜細胞增生浸潤，血管翳形成，最終導致四肢對稱性關節破壞。RA早期臨床常表現為對稱性四肢小關節腫痛、晨僵、關節功能下降，終末期常出現不可逆關節損傷、關節畸形、功能障礙，嚴重影響患者生活質量[1]。目前RA的治療藥物主要有非甾體類抗炎藥物、包括改善病情抗風濕藥和免疫抑制劑在內的慢作用抗風濕藥、糖皮質激素和生物制劑等[8]。這些藥物因能夠調節免疫反應、抑制局部炎癥、緩解關節腫痛、延緩病情發展而廣泛應用于RA治療。雖然這些藥物能夠在一定程度上改善患者癥狀，延緩病情進展，但仍無法逆轉RA病變。因此有必要尋找一種新的有效的RA潛在治療藥物。

CFZ為第二代不可逆性蛋白酶體抑制劑，通過特異性抑制20S蛋白酶體的糜蛋白催化位點達到抑制細胞生長作用，主要應用于多發性骨髓瘤治療[9]。也有文獻報道CFZ可以對未分化型甲狀腺癌[10]、頭頸部癌[5]和結腸癌[11]等起到一定治療作用。文獻報道顯示第一代蛋白酶體抑制劑對AIA大鼠有抗炎、抗RA作用[12]，但到目前為止，CFZ研究多集中在惡性腫瘤治療上，尚無關于CFZ對RA治療效果的研究報道。

AIA大鼠被廣泛應用于人類RA研究，其病理生理學特性很好地模擬了人類RA，其中包括炎癥反應、滑膜增生、骨破壞及關節退變[13]，常用于RA治療藥物的篩選研究。本研究采用弗氏佐劑誘導建立AIA大鼠，并使用AI對關節炎嚴重程度進行評估。免疫組化結果顯示關節切片中iNOS和COX-2高表達也同樣證實AIA大鼠炎癥因子大量釋放及建模成功。采用不同劑量CFZ對AIA大鼠治療觀察其抗RA療效，結果發現CFZ抗RA具有劑量依賴性、并表現出下調踝關節iNOS及COX-2表達水平的能力。預治療組和模型對照組比較結果顯示CFZ具有一定程度預防RA的作用；同時治療組和模型對照組比較結果提示在RA形成過程中使用CFZ可以達到更有效治療效果。TRAP染色結果同樣表明CFZ能夠抑制破骨細胞分化和形成，從而達到緩解RA進展效果。基于本研究所建立的AIA大鼠，采用不同劑量、不同治療時間對AIA大鼠進行治療，結果顯示CFZ具有治療RA的潛在作用。

TLRs是炎癥反應鏈的起始蛋白并通過募集多種適配蛋白、在細胞內啟動促炎癥/抗炎癥信號級聯反應，其亞型TLR4為關鍵信號傳導蛋白之一[14]。TLR2和TLR4主要在細胞膜中表達，研究顯示其在RA發病機制中起重要作用[15]。本研究采用qRT-PCR法分析治療組和模型對照組游離滑膜組織中TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達水平發現隨著CFZ劑量增加，TLR2、TLR4和MyD88表達水平明顯下調。據此推斷CFZ的抗RA機制可能為：TLR2、TLR4被激活后與MyD88的TLR結構域結合并聚集IL-1受體相關蛋白（IRAK），通過磷酸化IRAK4及IRAK1，進一步激活腫瘤壞死因子相關因子6（TRAF6），并依次降低下游信號蛋白轉錄生長因子β激酶 1（TAK1）、NF-κB 誘導激酶（NIK）及 IκB 激酶（IKK）的表達，解除對NF-κB抑制作用，使NF-κB進入細胞核并形成活化的p-NF-κB參與炎癥反應[16]。TLRs激活信號通路可能導致下游轉錄因子NF-κB及前炎癥因子產物 TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和 COX-2 激活、表達與分泌，引發宿主炎癥反應[17]。研究證實激活TLR4能夠進一步通過MyD88激活下游NF-κB，同時在RA患者和膠原誘導關節炎小鼠中均發現NF-κB被高度激活并參與滑膜炎癥性增生、關節軟骨破壞調節[18-19]。TLRs信號通路，尤其是TLR4/MyD88/NF-κB信號通路被證實是RA的重要發病機制[20]。本研究發現CFZ可以抑制滑膜細胞 TLR2、TLR4、MyD88 mRNA 表達，Western blot結果進一步證實CFZ能夠抑制游離滑膜細胞中TLR2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB 和 MyD88 蛋白表達。因此，筆者推斷CZF可能通過下調TLRs/MyD88/NF-κB信號通路達到抑制關節炎癥反應的效果。

綜上所述，本研究結果顯示CFZ對AIA大鼠有一定的治療作用及預防作用，其機制可能是通過下調關節iNOS及COX-2的表達，調控滑膜細胞TLRs/MyD88/NF-κB信號通路，降低關節炎癥反應及抑制破骨細胞而起到抗RA效果。