表沒食子兒茶素沒食子酸酯對脊髓損傷后小鼠神經功能的恢復作用及機制研究

吳凱 封志云 胡小堅

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經系統嚴重的損傷，常導致損傷平面以下感覺、運動功能障礙，致殘率高，給個人、家庭及社會帶來了巨大的負擔。目前，對于SCI仍無有效的治療方法。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中提取的多酚的活性成分，能清除氧自由基，易透過血腦屏障，是重要的天然抗氧化劑。研究表明，EGCG具有抗腫瘤、抗細胞凋亡、抗炎等多種生物學效應[1-3]。同時，大量研究證實EGCG對于神經細胞具有保護作用[4-5]，但其機制仍不明確。本研究采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動物模型，術后通過小鼠BMS評分評價EGCG對SCI后小鼠神經功能的恢復作用，并觀察脊髓組織細胞形態變化，檢測Cleaved Caspase-3、B細胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）蛋白表達水平，以探討其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取雌性健康SPF級C57BL/6小鼠35只，體重18～24g，購于上海實驗動物中心，于浙江大學實驗動物中心分籠飼養，每籠5只。動物飼養在屏障環境內，室溫控制在20～25℃，給予動物12h光照/12h黑暗交替的環境。所有動物自由攝食攝水。操作均嚴格遵守《實驗動物管理條例》的相關規定。

1.2 主要器材和試劑 血管夾（15g）購自上海醫療器械有限公司，EGCG（E4143，50mg）購自美國 Sigma-Aldrich公司，Cleaved Caspase-3抗體（9661）和 Bax抗體（14796）購自美國Cell Signalling Technology公司、Bcl-2抗體（ab182858）購自美國Abcam公司。

1.3 小鼠急性SCI動物模型建立及分組 采用擠壓型方法制作小鼠急性SCI動物模型，具體操作如下：用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔內注射麻醉小鼠，俯臥位固定，常規備皮、消毒、鋪巾。在T8～10水平作背部正中切口，充分暴露并切除T8～10棘突及椎板，充分暴露脊髓T9節段，用15g力度的血管夾夾住T9段脊髓1min，夾閉1min后放開血管夾。止血后逐層縫合切口。制作SCI小鼠25只，為保證模型統一標準，造模后進行行為學檢測，選取行為學評分≤1分的小鼠20只（剔除行為學評分＞1分的小鼠5只）。采用隨機數字表法將造模成功的20只小鼠分為EGCG組和SCI組，每組10只。另10只未造模的小鼠僅行椎板切除，作為假手術組。EGCG組小鼠于造模后給予EGCG（50mg/kg，50mg溶于10ml 0.9%氯化鈉注射液，10ml/kg）腹腔注射，1次/d，連續 7d。假手術組和SCI組小鼠給予0.9%氯化鈉注射液（10ml/kg）腹腔注射，1 次/d，連續 7d。

1.4 行為學評分 根據文獻報道[6]，將小鼠后肢運動功能分為10個等級，完全正常行走為9分，后肢完全癱瘓為0分。分別于術后第1、3、5、7天進行小鼠BMS評分，將動物置于寬闊活動場地自由活動5min，觀察其后肢運動情況，左右兩側肢體分別評分，取平均值為每只大鼠的功能得分。由不參與動物分組與治療但熟悉評分標準的2位觀察者同時獨立進行評分，取平均值。

1.5 脊髓組織細胞形態變化觀察 術后第7天，每組取6只小鼠進行病理學觀察，腹腔注射過量戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，經左心室灌注0.9%氯化鈉注射液至流出澄清液，再用4%多聚甲醛心臟灌注固定后，以損傷中心區為中點取1cm左右脊髓組織樣本，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定，再行脫水、包埋、切片等步驟，行HE染色，鏡下觀察各組脊髓瘢痕和空洞面積，評價脊髓損傷程度。

1.6 脊髓組織Cleaved Caspase-3表達水平檢測 采用免疫組化法。上述小鼠每只取5張距損傷中心或相應部位0.5cm內的切片，常規脫蠟，3%過氧化氫處理、高溫修復、血清封閉、一抗 4℃過夜（濃度為 1∶150），同時用PBS代替一抗作為陰性對照，隔日滴加二抗，室溫孵育30min，繼而二氨基聯苯胺（DAB）顯色，甘油封片后，倒置顯微鏡下觀察切片陽性表達（棕色）的部位及強弱程度，用Image-Pro Plus 6.0軟性行平均光密度分析。以上各步驟間均用PBS充分漂洗3次，5min/次。

1.7 脊髓組織Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。術后第7天，每組取4只小鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死，直視下取出包含損傷部位在內的1cm脊髓組織，獲取脊髓蛋白，根據蛋白濃度進行等量上樣，電泳，轉印，5%脫脂奶粉封閉，4℃一抗 Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 孵育過夜，洗膜，室溫下熒光二抗孵育1h，充分洗膜，ECL試劑發光，暗室曝光顯影。凝膠成像分析系統上攝像分析，并定量分析條帶灰度。

1.8 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠BMS評分比較 SCI后，小鼠雙后肢均全癱。與假手術組比較，術后各時點SCI組和EGCG組小鼠BMS評分均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與 SCI組比較，術后第 3、5、7 天 EGCG 組小鼠BMS評分均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 3組小鼠BMS評分比較（分）

2.2 小鼠脊髓組織病理檢查結果 HE染色結果顯示假手術組小鼠脊髓組織結構完整，神經細胞分布均勻；SCI組小鼠脊髓組織中神經細胞核仁模糊，細胞腫脹，周圍間隙增大，出現大量壞死細胞，形成大量空泡，炎性細胞浸潤程度高；EGCG組小鼠壞死神經細胞較SCI組有所減少，空泡數量減少，炎性細胞浸潤程度低，見圖1。

圖1 小鼠脊髓組織病理切片所見（a：假手術組；b：SCI組；C：EGCG組；HE染色，×20）

2.3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達水平比較 術后第7天，與假手術組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3的表達有所降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2-3。

圖2 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3免疫組化染色結果（a：假手術組小鼠Cleaved Caspase-3無明顯陽性表達；b：SCI組小鼠可見大部分細胞表達強陽性；C：EGCG組小鼠可見部分細胞表達陽性；免疫組化染色，×40）

圖3 3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3表達的平均光密度值比較（與假手術組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

2.4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關蛋白表達水平比較 術后第7天，與假手術組比較，SCI組和EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達水平均升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與SCI組比較，EGCG組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3及Bax蛋白表達水平均降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3組小鼠脊髓組織凋亡相關蛋白表達水平比較（a：3組小鼠脊髓組織凋亡相關蛋白表達的電泳圖；b：3組小鼠脊髓組織Cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較；c：3組小鼠脊髓組織Bax蛋白表達水平比較；d：3組小鼠脊髓組織Bcl-2蛋白表達水平比較；與假手術組比較，*P＜0.05；與 SCI組比較，△P＜0.05）

3 討論

本研究發現，經EGCG治療后，SCI小鼠的BMS評分明顯升高，提示EGCG可明顯改善SCI小鼠神經功能的恢復。SCI可分為原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷發生在損傷當時，其結果是不可逆的，而繼發性損傷則是損傷后發生的一系列復雜的分子生物學反應引起的神經元可逆性損傷，因此，有效抑制繼發性損傷是治療SCI的重點。脊髓繼發性損傷的過程十分復雜，其機制包括缺血缺氧[7]、脂質過氧化[8]、細胞內鈣離子超載[9]、興奮性氨基酸毒性[10]、神經細胞凋亡[11]等。其中，神經細胞凋亡是繼發性損傷的重要病理基礎，因此，抑制神經細胞凋亡可有效減少繼發性損傷，促進神經功能恢復。

細胞凋亡是受一系列連續基因調控的程序化反應，通?？梢苑譃樗劳鍪荏w（外源性）和線粒體（內源性）兩條途徑。在凋亡過程中，Bcl-2家族蛋白起重要調控作用，主要參與細胞的內源性凋亡途徑完成對細胞凋亡的調控。Bcl-2家族可以分為兩類：一類是抗凋亡基因，代表基因是Bcl-2基因；另一類是促凋亡基因，代表基因是Bax基因。而Caspase-3是細胞凋亡蛋白級聯反應的必經之路，當細胞發生凋亡時，Caspase-3被活化成Cleaved Caspase-3，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志[12-14]。EGCG是從綠茶中提取的多酚的活性成分，研究表明，EGCG具有很強的抗氧化活性，可抑制各種誘因導致的細胞凋亡，對細胞具有保護作用。Shi等[15]研究發現，EGCG可以通過激活NRF2/HO-1通路來抑制微囊藻毒素誘導的人臍靜脈血管內皮細胞的凋亡；Yan等[16]研究發現，EGCG可以通過抑制氧化應激來抑制H2O2誘導的血管平滑肌細胞的凋亡；Du等[17]研究發現，EGCG可以通過抑制內質網應激介導的細胞凋亡來減少阿爾茲海默病中的神經毒性。本實驗觀察到，SCI小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，EGCG治療后，小鼠Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達水平均降低，Bcl-2蛋白表達水平升高，提示EGCG對SCI小鼠有明顯的抗凋亡作用。

綜上所述，EGCG治療可明顯促進SCI小鼠神經功能的恢復，其對小鼠發揮神經保護作用的機制可能與抑制神經細胞凋亡密切相關。本研究結果證實了EGCG治療對SCI小鼠的保護作用，這為SCI的基礎和臨床治療提供了一定的理論基礎。然而，這一作用具體的分子機制還需進一步的研究去揭示。