米根霉復合誘變篩選高產L-乳酸的形態突變菌株及碳代謝流分析

孫小龍 付永前

摘要：以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL 395為出發菌株，通過紫外線與亞硝基胍（nitroso-guanidin，簡稱NTG）復合誘變，篩選出幾株形態突變株，其L-乳酸產量較高，在此基礎上，對得到的3株形態突變菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3和出發菌株NRRL 395進行代謝流分析。結果表明，在發酵初期，不同菌種的碳代謝流整體變化差別并不明顯，尤其是流向有機酸合成的碳源所占的比例基本相同，此時細胞更多地合成生物量以及代謝所需的蛋白，對于球狀菌體，其流向生物合成所需的碳相對較多;當發酵進入后期，碳流更多地用于有機酸的合成，而此時，不同菌體形態的碳代謝流明顯發生變化，均勻球狀菌體更有利于碳代謝流的流動，尤其是LA-UN-1球狀菌體碳代謝流更易于流向L-乳酸合成途徑，而原始菌株流向L-乳酸合成途徑的碳流最小。

關鍵詞：米根霉;L-乳酸;碳代謝流;形態突變菌株;誘變選育

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0294-05

乳酸是世界上公認的三大有機酸之一，用途極為廣泛。乳酸作為一種古老而重要的有機酸，自1780年首次被發現至今，已被廣泛應用于食品、醫藥、農業、化工等方面[1-3]。按其構型及旋光性可分為L-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸等3類。L-乳酸是一種重要的天然有機酸[4]，世界上對L-乳酸的需求量在逐年上升，增長率高達15%，尤其近幾年，人們利用L-乳酸聚合生成聚乳酸（polylactic acid，簡稱PLA），用以解決日益嚴重的環境污染問題，具有重大意義[5-6]。當前，L-乳酸生產方法分為發酵法、合成法和酶法，發酵法一般是以玉米、大米、甘薯等淀粉質為原料，經微生物綜合利用代謝而成[7]。米根霉（Rhizopus oryzae）由于合成L-乳酸光學純度高，而被越來越多地應用于L-乳酸的發酵生產中，但米根霉發酵由于其菌體形態不穩定而影響其應用。球狀菌體作為米根霉合成L-乳酸的潛在形態而越來越引起人們的關注，針對菌球形態控制的研究也越來越廣泛[8-9]。目前，大量文獻報道，絲狀真菌的菌體形態受遺傳因素控制[10-12]。在此基礎上，本試驗嘗試利用紫外線和亞硝基胍（nitroso-guanidin，簡稱NTG）復合誘變，篩選有利于L-乳酸高產的形態突變株，并深層次探討L-乳酸高產形態突變菌株、出發菌株在不同階段的代謝流變化，以期為米根霉形態的基因調控研究提供經驗和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 米根霉（Rhizopus oryzae）出發菌株NRRL 395，由臺州學院生物質資源研究所保藏。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡稱PDA）培養基：稱取200 g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30 min，用雙層紗布過濾，向濾液中添加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，補水至1 000 mL，于121 ℃滅菌30 min。種子培養基：30 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。發酵培養基：100 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養條件與方法 將米根霉NRRL 395接種于PDA斜面培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱中培養7 d，取培養好的斜面菌種，用無菌生理鹽水洗脫孢子，接入三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩30 min，打碎孢子團塊與孢子囊，使孢子充分散開，經無菌脫脂棉過濾，用血球計數板計數并調整孢子濃度為106個/mL;取1 mL孢子液接入裝有50 mL種子培養基的 250 mL 三角瓶中，于30 ℃、200 r/min恒溫搖床中培養24 h得到種子液;種子液接入5 L發酵罐（購自上海保興生物設備工程有限公司）進行發酵。發酵條件：溫度為30 ℃，攪拌轉速為200 r/min，裝液量為3 L，接種量為10%，通氣量為 1.0 L/min，pH值用CaCO3控制在5.5～6.0范圍內。

1.2.2 復合誘變選育 采用紫外線與NTG進行復合誘變選育，具體參考文獻[13]。首先取0.5 mL孢子液，均勻涂布在直徑為90 mm無菌培養皿上，用無菌風風干后，在30 W紫外燈下照射20 min，照射高度為20 cm;然后用0.5 mL生理鹽水洗脫，洗脫的孢子懸濁液用濃度為100 g/mL的磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）在30 ℃條件下處理60 min。最后把反應液均勻涂布在配好的PDA培養基平板上，30 ℃培養2～4 d，生長出的米根霉菌體成熟后洗脫進行種子和發酵培養，進而篩選菌體形態和L-乳酸高產菌種。

1.3 代謝流網絡模型建立

細胞大分子物質（糖、脂類、蛋白質） 涉及的代謝網絡非常復雜，要建立一個完整的網絡是比較困難的，因此作簡化處理。根據相關文獻[14-17]、米根霉的生化反應網絡[18]以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡稱KEGG）等數據庫資源，結合米根霉的生長代謝特性，建立米根霉利用葡萄糖發酵產乳酸的反應網絡及其代謝流網絡模型（圖1），其中包括主要的碳骨架代謝途徑。

構建代謝網絡模型時作出以下簡化和假設：（1）只考慮主要中心碳代謝反應的物流平衡;（2）對于中間代謝物的代謝庫采用擬穩態假設，即瞬間濃度變化速率為0;（3）幾個連續且無分支點的反應簡化成1個反應式，所有反應方程包括生物量合成的過程均按固定比例進行;（4）能量供需平衡，即維持生物量與產物生成反應途徑中消耗的能量與糖酵解途徑（又稱EMP途徑，embden-meyerhof-parnas pathway，簡稱EMP途徑）、三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，簡稱TCA）產生的能量總數相等，輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，簡稱NADH）與還原型核素二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，簡稱FADH2）都可以通過電子傳遞鏈生產腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，簡稱ATP）;（5）菌體組分，如DNA、RNA、蛋白質等大分子的合成途徑使用米曲霉反應模型[11]，在磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，簡稱PPP）的中間代謝產物中亦有流向大分子的流量，但由于與其他標出的途徑相比流量甚微，因此忽略不計;（6）葡萄糖進入細胞時須消耗ATP;（7）TCA作為主要的能源提供途徑，其中間代謝物的積累可以忽略不計。模型中包含的反應如表1所示。整個代謝網絡含有53個反應，44個中間代謝物，此時自由度為9。該代謝網絡中有6個可測速率，即葡萄糖消耗速率以及乳酸、富馬酸、乙醇和生物量的生成速率，加上二氧化碳的含量變化速率。由于可測定的速率數量小于自由度，通過Matlab 7.5軟件求解代謝分布。在此代謝網絡中，葡萄糖作為碳源被細胞吸收，因此在代謝通量的計算中，將不同時間段初始葡萄糖利用的比值定義為100。

1.4 分析方法

發酵液的預處理：每隔一段時間對發酵液進行取樣，于高速離心機上3 000 r/min離心10 min，分離得到上清液用于成分的檢測;葡萄糖、L-乳酸、富馬酸、蘋果酸、乙醇、CO2的檢測方法參考文獻[13]。細胞干質量測定：對發酵液進行過濾，用蒸餾水洗滌2～3次，置于60 ℃恒溫鼓風干燥箱至烘干至恒質量，用電子天平稱質量。菌體電鏡觀察方法參考文獻[19]。

2 結果與分析

2.1 復合誘變處理米根霉NRRL 395菌株

利用紫外線和NTG復合誘變處理出發菌株NRRL 395。誘變處理過后，經過初篩和復篩，篩選出高產L-乳酸的形態突變株，這些菌株與出發菌株NRRL 395相比，在相同的培養條件下易形成球狀菌體，并且L-乳酸含量比出發菌株高，進一步對這幾株菌株的菌體形態進行電鏡觀察發現，其球狀菌體形態在微觀環境下各異（圖2），LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3等3株菌株的菌球形態較為規則，近乎圓形;LA-UN-4、LA-UN-5、LA-UN-6等3株菌株的形態偏向于橢圓形，而且形態越來越不規則;LA-UN-7、LA-UN-8等2株菌株的菌球形態較為松散，基本呈現放射狀;另外，在菌球周邊菌絲分布上，LA-UN-1菌株形成的菌球較為光滑，菌絲分散較少，其他菌株的菌球周邊菌絲呈不同程度的放射狀，尤以LA-UN-7、LA-UN-8最為明顯。與此同時，對以上8株菌株與出發菌株進行乳酸發酵試驗。觀察發現，其乳酸產量差別較大，其中LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株的乳酸產量相對較高，最高均達到 40 g/L 以上，均高于原始菌株，而其他5株菌株，雖然也成球狀菌體，但乳酸產量都偏低。對LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株在相同條件下培養得到的菌體進行乳酸發酵并進行觀察發現，LA-UN-1菌株的產酸能力要明顯高于LA-UN-2、LA-UN-3菌株（圖3），且LA-UN-1傳10代后，其乳酸產量以及菌球形態并未發生較大變化。

本試驗利用紫外輻射和亞硝基胍復合誘變產乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形態突變菌株LA-UN-1，該菌株培養易形成直徑在1.0～1.4 mm之間的球形菌體，在該菌株培養形態下，L-乳酸發酵產量最高達到59.5 g/L，比野生株產量提高54.5%。雖然，在之前的研究過程中發現，不同的培養條件如培養基、pH值等對菌體的形態都有影響，然而在篩選乳酸高產突變株的過程中，意外地發現通過紫外線和NTG誘變，同樣可以得到形態突變菌株。從而，進一步驗證了通過誘變選育手段，同樣可得到形態誘變菌株。因此，可以進一步推測，生物個體發育與基因有序的選擇性表達有關，許多變異的產生都是由于基因表達的變化所致，因此，通過比較同一類細胞給予不同刺激而產生的差異表達基因，可為揭示形態變化規律，探索菌體形態形成機制提供強有力的依據。

2.2 誘變菌株與出發菌株的代謝流分析

以選育所得到3株菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 和出發菌株NRRL 395進行發酵試驗，并對發酵 24 h 后以及發酵結束后進行代謝流分析。由圖4-A可知，在發酵初期，碳源的整體變化差別并不是很明顯，尤其是流向有機酸合成的碳源所占的比例基本相同，而此時，碳源流向生物大分子物質的流量多一些，無論是氨基酸、核酸，還是碳水化合物或脂類均明顯大于發酵后期，說明在發酵前期， 細胞更多地合成生物量以及代謝所需的蛋白， 且此時細胞中參與生物量積累反應須要消耗大量的能量和小分子物質，如氨基酸、核苷酸等。同時也發現，對于球狀菌體，其流向生物合成所需的碳流量相對較多，也可能是菌球在聚集過程中，需要更多的物質來參與聚集反應。

從圖4-B中可以看出，發酵后期流向生物大分子的碳流與發酵前期相比明顯減少，而有機酸合成的碳流逐漸增加，由此可見，當發酵進入指數期后，碳流更多地用于有機酸的合成，而此時，不同菌體形態的碳流明顯發生變化，流向乳酸的碳流在球狀菌體下，尤其是LA-UN-1菌株培養的菌球最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小，與最大碳流相比，減少44%以上，而此時流向生物大分子的碳流相差不大。因此，筆者進一步分析認為，其原因可能是球狀菌體在發酵前期，菌體合成了更多有利于乳酸合成的生物大分子或環境，其具體原因還有待于進一步研究。

3 結論

本試驗利用紫外輻射和亞硝基胍復合誘變產乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形態突變菌株LA-UN-1，該菌株培養易形成直徑在1.0～1.4 mm之間的球形菌體，在該菌株培養形態下，L-乳酸發酵產量最高達到59.5 g/L，比野生株產量提高了54.5%;在擬穩態的假設基礎上，根據乳酸合成涉及到的生化過程以及菌體生長、產物的代謝過程，構建米根霉的乳酸代謝網絡數學模型，并對誘變菌株和出發菌株進行代謝流對比分析;菌種在發酵初期，球狀菌體流向生物合成所需的碳流量相對較多。當發酵進入指數期后，LA-UN-1流向乳酸的碳流最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小。不同的培養條件如培養基、pH值等對菌體的形態都有影響，因此針對下一步的研究，可以通過優化培養基改變菌體形態，以提高乳酸的產量，培養基的組分可以影響發酵產物的濃度、轉化率、生產強度等。因此，可以采用單因子試驗、Placket-Burman設計和中心組合設計試驗對改組后的優良菌株進行培養基優化，以提高L-乳酸的產率和對糖的轉化率并降低發酵成本，為該菌株的工業化生產打下基礎。

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