禽畜糞便中抗生素耐藥菌的分離與分子鑒定

劉偉杰 賀小娜 韓珊珊

摘要：近年來，各種抗生素在禽畜養殖業中被大量濫用，導致抗生素耐藥菌大量產生，嚴重危害生態環境和人體健康。通過對4個不同地區禽畜糞便中的抗生素耐藥菌進行分離，共分離到17株不同的耐藥菌，其中12株可以耐受2種及以上的抗生素。通過16S rRNA序列比對分析確定了耐藥菌株的種屬地位，對于了解喂食抗生素禽畜糞便中常見的耐藥菌具有一定的理論指導意義，同時也為含有抗生素廢水的治理積累了菌種資源。

關鍵詞：禽畜糞便;抗生素;耐受性;分離;分子鑒定

中圖分類號： S852.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0291-03

我國是抗生素生產和使用大國，每年生產抗生素20萬t，其中有40%左右被用于禽畜養殖業，尤其在雞、鴨、豬的養殖中使用更為嚴重[1-2]。常見的抗生素如四環素、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素等可以有效殺滅病原菌，在短時間內可以減少畜牧養殖業因病原菌引起的經濟損失[3]。然而，隨著我國規模化、集約式畜禽養殖業的快速發展，抗生素的使用量急劇增加。養殖戶為了追逐經濟利益，濫用抗生素，使得大部分抗生素未被利用便隨糞便和尿液排出體外，造成動物糞便中抗生素含量嚴重超標[4]，因此，在畜禽糞便中產生了大量的抗生素耐藥微生物[2，5]，甚至是超級細菌。

在我國，越來越多的禽畜糞便被資源化處理，制成有機肥被施用在農田土壤中。糞便中含有的耐藥微生物所攜帶的質粒、轉座子等成為抗性基因轉移和傳播的主要因素，這些耐藥微生物可以通過直接或者間接接觸（如食物鏈）等途徑進入人體，從而給人類公共健康帶來威脅[6-7]。耐藥微生物和耐藥基因已經成為新型的污染源，引起人們的廣泛關注，然而目前對禽畜養殖糞便中常見耐藥菌的研究還較少。

本研究從江蘇不同地區的養殖場采集了4個禽畜糞便樣品，分別為無錫市宜興養鴨場糞便、徐州市沛縣養鴨場糞便、徐州市沛縣養雞場糞便、徐州市豐縣養鴨場糞便。通過耐藥菌的分離純化共篩選到17株不同的耐藥菌株，并對所獲得的菌株進行了多重抗生素耐藥菌分析。在此基礎上，利用16S rRNA分子生物學技術分析了所獲得的耐藥菌株的種屬地位。本研究對于了解禽畜糞便中常見的耐藥微生物、指導抗生素在畜牧養殖業中的合理使用具有很好的理論意義，同時也為抗生素廢水和抗生素污染土壤的修復提供了菌種資源。

1 材料與方法

1.1 禽畜糞便的來源與采集

禽畜糞便樣品分別采集于江蘇省無錫市宜興養鴨場、徐州市沛縣養鴨場、徐州市沛縣養雞場、徐州市豐縣養鴨場。采集糞便樣品后，迅速帶回實驗室于4 ℃保藏，并及時進行菌種分離。

1.2 分離培養基

LB培養基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母粉，10 g/L氯化鈉，20 g/L瓊脂，于115 ℃滅菌30 min。滅菌后待溫度降至55 ℃左右，加入相應的抗生素后倒平板。抗生素的使用濃度為其常用的抑菌濃度：50 mg/L卡那霉素，20 mg/L四環素，50 mg/L 氨芐青霉素，50 mg/L紅霉素，50 mg/L慶大霉素。

1.3 抗生素耐藥菌的分離

分別取4個禽畜糞便樣品各1 g，加入9 mL 0.9% NaCl溶液中，利用渦旋振蕩器充分混勻。靜置5 min后，取0.1 mL上層液體均勻涂布于含有不同抗生素的固體培養基平板上（以沒有抗性的Escherichia coli DH5α作為陰性對照，涂布于抗性平板上以驗證抗性平板的有效性），于37 ℃恒溫培養箱中倒置培養24 h后，從形態學上排除從同一樣品中分離獲得的相同菌株，然后從平板上挑取單菌落在同種抗生素培養基平板上進行四區劃線純化，將純化后的單菌落接種于含有相應抗生素的液體培養基中進行搖瓶培養，于37 ℃、180 r/min 培養24 h驗證其耐藥性。將獲得的純種耐藥菌株發酵液與30%甘油等體積比混合后，保藏于-80 ℃冰箱中待用。

1.4 菌株的多重抗生素耐受性分析

將分離得到的17株抗生素耐受菌株進行多重抗生素耐受性分析。將純化好的菌株進行活化培養，然后涂布在不同的抗生素平板上（分別含50 mg/L卡那霉素、20 mg/L四環素、50 mg/L氨芐青霉素、50 mg/L紅霉素、50 mg/L慶大霉素），檢測其耐受性，若生長，即為耐受，若不生長，即為不耐受，統計菌株對抗生素的多重耐藥性。

1.5 抗生素耐藥菌的分子鑒定

將分離獲得的17株耐藥菌株接種于含有相應抗生素的LB液體培養基中，搖瓶過夜培養。于10 000 r/min、4 ℃離心收集菌體，利用細菌基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取菌株的基因組DNA。以提取獲得的基因組DNA作為模板，分別擴增菌株的16S rRNA序列。用于PCR擴增的上下游引物分別為5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR反應體系的總體積為50 μL，在0.2 mL Eppendorf管中依次加入5 μL 10×buffer、1 μL dNTP、1 μL正向引物、1 μL反向引物、1 μL模板DNA、0.5 μL DNA聚合酶，加ddH2O補足總體積至 50 μL。PCR反應條件如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環;72 ℃ 10 min。將擴增獲得的16S rRNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用PCR產物純化試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]純化后，交北京博邁德基因技術有限公司測序。將測得的16S rRNA序列提交至GenBank數據庫中進行BLAST比對分析，確定耐藥菌株的種屬地位。

2 結果與分析

2.1 抗生素耐受菌株的分離

本研究利用含有常用抑菌濃度的卡那霉素、四環素、氨芐青霉素、紅霉素、慶大霉素的平板分離禽畜糞便中的耐藥菌株。如表1所示，從4份禽畜糞便樣品中共分離獲得17株不同種屬的抗生素耐藥菌株，其中從無錫市宜興養鴨場分離到5株，從徐州市沛縣養鴨場分離到4株，從徐州市沛縣養雞場分離到4株，從徐州市豐縣養鴨場分離到4株。4個樣品中的耐藥菌都以耐受四環素為主，這一趨勢符合當前四環素被大量用于禽畜養殖業的現狀。四環素是在禽畜養殖業中實際使用量最大的抗生素[8-9]，在抗生素的選擇性壓力下，導致禽畜養殖糞便中四環素耐藥菌最多。

2.2 抗生素耐受菌株的分子生物學鑒定

對分離獲得的17株抗生素耐藥菌的16S rRNA基因進行PCR擴增和序列分析，將得到的序列結果通過與NCBI（美國國立生物技術信息中心）數據庫中目前已報道的16S rRNA序列進行比對，確定耐藥菌種的種屬地位。如表2所示，從無錫宜興養鴨場糞便中分離到的5株抗生素耐藥菌分別為氣味類香菌（Myroides odoratus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、吉氏庫特菌（Kurthia gibsonii）、堅強芽孢桿菌（Bacillus firmus）;從徐州沛縣養鴨場糞便中分離到的4株耐藥菌分別為漢氏鹽單胞菌（Halomonas hamiltonii）、腸球菌（Enterococcus eurekensis）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）、嗜氣芽孢桿菌（Bacillus aerophilus）;從徐州沛縣養雞場糞便中分離到的4株耐藥菌分別為副凝膠短狀桿菌（Brachybacterium paraconglomeratum）、尿道氣球菌（Aerococcus urinaeequi）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）;從徐州豐縣養鴨場中分離到的4株耐藥菌分別為酯香微桿菌（Microbacterium esteraromaticum）、 微桿菌（Microbacterium suwonense）、 玫瑰紅紅球菌（Rhodococcus rhodochrous）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 多重抗生素耐受菌株分析

如表2所示，從4個禽畜糞便樣品中分離到的17株耐藥菌中有4株可以耐受2種抗生素，3株可以耐受3種抗生素，4株可以耐受4種抗生素[分別為氣味類香菌（Myroides odoratus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）和孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）]，1株可以耐受5種抗生素，為糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）。多重抗生素耐藥菌的出現會導致抗生素失效，威脅禽畜養殖的安全，同時對環境與人類健康構成嚴重威脅，因此應采取措施積極引導和監督養殖戶減少或避免使用抗生素。

3 討論

近年來，多種抗生素被添加到禽畜飼料中，用于防范養殖過程中病害的發生。抗生素的大規模濫用導致抗生素耐藥菌問題惡化，而且出現了多重耐藥菌，甚至是超級細菌。耐藥菌的產生嚴重威脅著環境安全和人類健康[10]。耐藥菌導致抗生素效果減弱，如藥物使用劑量增大、抑菌過程延長、疾病復發率升高等，甚至會使抗生素失效，導致禽畜或病人的死亡率升高。目前，人們已經發現了多株多重耐藥病菌，如糞腸球菌、肺炎分支桿菌和綠膿假單胞菌，因此可見耐藥菌的問題引起了人們的廣泛關注[11-12]。然而，目前對抗生素濫用導致禽畜糞便中耐藥菌形成情況的研究還較少。

本研究從4種禽畜糞便樣品中共分離獲得17株不同的耐藥菌，并分析了這些菌株對多重抗生素的耐受性。結果表明，在17株耐藥菌中有3株可以耐受3種抗生素;4株可以耐受4種抗生素，分別為氣味類香菌、大腸桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和孔氏葡萄球菌;1株可以耐受5種抗生素，為糞產堿桿菌。本研究新發現了多株多重耐藥菌，其中包括致病菌株，如氣味類香菌、大腸桿菌、葡萄球菌和糞產堿桿菌等，糞產堿桿菌可寄生在動物的腸腔中，可機會性致病，引起腸炎等。本研究對于指導禽畜養殖中合理使用抗生素具有一定的理論指導意義。

抗生素在畜牧養殖業中的長期濫用導致養殖動物糞便中耐藥菌株數增加，這些攜帶抗生素抗性基因的菌株是環境中抗生素抗性基因最重要的來源之一[5]。目前從世界上很多國家、地區的肉、牛奶等樣品中檢測到的腸球菌均攜帶抗生素抗性基因。雖然一些耐藥性菌株不具有致病性，卻能夠將耐藥基因水平轉移給致病菌，因此嚴格控制禽畜養殖等領域的抗生素使用量迫在眉睫。

4 結論

本研究從4個地區的禽畜糞便樣品中共分離出17株不同的耐藥菌，其中有4株可以耐受2種抗生素，3株可以耐受3種抗生素，4株可以耐受4種抗生素，1株可以耐受5種抗生素。本研究對于了解禽畜養殖業中常見的耐藥菌具有一定的理論指導意義，同時也為含有抗生素廢水的處理積累了菌種資源。

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