連續流動法快速測定基因編輯素材中淀粉含量

黃海濤，許 永，王 晉，劉 欣，孔維松，楊葉昆，李雪梅，楊光宇，張承明，李 晶

云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市高新區科醫路41 號 650106

淀粉是高等植物中碳水化合物貯藏的主要形式，成熟的新鮮煙葉中淀粉含量高達40%。與其他植物相比，新鮮煙葉中的淀粉只是碳水化合物的暫時貯存形態。煙葉經調制、發酵后，淀粉大部分轉化為小分子碳水化合物，而小分子碳水化合物在卷煙燃吸過程中會裂解產生酸性物質，這些酸性物質在中和含氮化合物燃燒過程中產生的堿性物質方面發揮重要作用，因此，要提高烤煙的感官品質必須平衡好烤煙煙葉中淀粉含量與煙堿、含氮化合物含量之間的關系。鑒于適宜的淀粉含量對卷煙香氣和吸味品質的重要性［1-4］，準確測定烤煙煙葉中的淀粉含量對于煙葉和卷煙產品的品質評價具有重要意義。

目前煙草樣品中淀粉含量的測定方法主要有分光光度法［5-6］、連續流動分析法［7-11］、高效液相色譜法［12］、離子色譜法［13］、近紅外光譜法［14］等。采用高效液相色譜法和離子色譜法測定煙草中的淀粉時，需要先脫除煙草樣品中的水溶性糖，然后用酸或酶將淀粉水解為單糖進行測定，并將單糖含量換算為淀粉含量；這兩種方法的水解過程操作繁瑣、耗時長，不適合于大批量煙草樣品中淀粉含量的測定。連續流動分析法操作簡便、快速，目前已成為煙草行業廣泛應用的標準方法YC/T 216—2013［9］（簡稱標準方法）。然而，連續流動分析法的樣品前處理操作步驟仍然較繁瑣，不利于批量樣品的分析。

隨著煙草行業基因編輯工廠化育種工作的啟動，在育種過程中通過基因編輯技術會產生數萬個素材，現有的分析方法難以滿足這些海量素材的化學分析和評價需求。因此，對煙草淀粉測定的樣品前處理方法進行了改進，通過設計一種無需樣品轉移即可實現去除干擾成分、萃取和過濾的樣品萃取瓶并將其作為前處理裝置，建立基于連續流動法快速測定基因編輯素材中淀粉含量的方法，旨在為大量基因編輯素材淀粉含量的測定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

烤煙（云南玉溪，C3F 等級）、白肋煙（湖北恩施、C2F 等級）、香料煙（云南保山、AB 等級）；基因編輯素材（分苗期、團棵期、旺長期、成熟期4 個階段采樣）。

本實驗中所用試劑均參照標準方法中所述方案進行配制，除特殊說明外，所用試劑均為分析純或以上級別。

AL204 型電子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo 公司）；KR-934CFS 型超聲波發生器（東莞市鎧瑞超聲自動化科技有限公司）；樣品萃取瓶（本項目組設計）；AA3 型連續流動分析儀（德國Bran+Luebbe 公司），由取樣器、比例泵、滲析器、螺旋管、比色計（配570 nm 濾光片）等部件組成，管路組成見圖1。

1.2 方法

1.2.1 樣品萃取瓶設計

本項目組設計了適合于連續流動分析儀的樣品萃取瓶，改進的樣品萃取瓶見圖2。該樣品萃取瓶由外套管（圖2a）和帶20 μm 過濾篩板及密封圈的內套管（圖2b）組成。萃取瓶外套管的內徑為3.0 cm，高度為8.0 cm；內套管外徑為2.9 cm，長度為10.0 cm；密封圈厚度為0.6 mm，其與外套管形成密封。使用前先檢驗萃取瓶密封性，以0.13～0.15 MPa（約1.3～1.5 倍大氣壓）下密封圈處不漏液為合格。該樣品萃取瓶可重復使用，每次使用完畢后清洗干凈并晾干，即可再次使用。

1.2.2 標準溶液配制

煙草中的淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉構成，一般認為二者的比例為2∶8，在實際樣品測定中，標準溶液中直鏈和支鏈淀粉的比例直接影響測定結果，因此本研究中采用直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例為2∶8 配制標準溶液。標準儲備液和工作溶液的具體配制參照標準方法［9］。

1.2.3 樣品處理與分析

圖1 淀粉檢測的流動分析儀管路系統Fig.1 Pipelines of continuous flow analyzer for starch detection

圖2 改進的連續流動分析儀樣品萃取瓶及操作過程Fig.2 Sample extraction vial and operation process of modified continuous flow analyzer

將成品煙葉樣品于40 ℃下干燥2 h，粉碎并過425 μm（40 目）篩；將新鮮煙葉樣品采樣冷凍干燥24 h，粉碎并過篩。稱取0.25 g 樣品，加入萃取瓶外套管中（圖2a）；將外套管放置于試管架上，加入25 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液；依次插入帶有20 μm 過濾篩板的內套管（圖2c），將裝有樣品的試管架放置于超聲波發生器中，于室溫下超聲萃取30 min；萃取結束后，向下推動內套管（圖2d），使萃取液通過過濾篩板進入內套管（含淀粉的樣品殘渣留在外套管中），棄去濾液（以去除樣品中的干擾物質）；向棄去萃取液的內套管中加入10 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，向上拉動內套管，使80%乙醇-氯化鈉飽和溶液通過篩板進入外套管（圖2e）；充分振蕩以洗滌樣品，洗滌完畢后將內套管下壓（圖2d），棄去洗滌液。

向棄去洗滌液的內套管中加入25 mL 40%（體積分數）高氯酸溶液，將內套管向上拉，使高氯酸溶液通過篩板全部進入外套管（圖2e），于室溫下超聲萃取10 min；萃取結束后將內套管下壓（圖2d），使淀粉萃取液通過過濾篩板進入內套管；向內套管中加入25 mL 水，混合均勻；將內套管中的淀粉萃取液轉移至250 mL 容量瓶中，用水定容至刻度；將定容后的樣品溶液轉移至連續流動分析儀的進樣杯中，根據淀粉在酸性條件下與碘發生顯色反應的原理，于570 nm 下進行比色測定。

2 結果與討論

2.1 新型樣品前處理裝置的設計

標準方法中采用砂芯漏斗進行樣品過濾前處理操作：將待測樣品置于砂芯漏斗中，加入80%乙醇-氯化鈉飽和溶液；超聲萃取除去雜質后再用40%高氯酸萃取樣品；將萃取液按照1∶10 稀釋后進行測定。在整個前處理過程中，需將砂芯漏斗置于裝有400 mL 水的燒杯中，除雜、洗滌、萃取淀粉過程中均需取出漏斗逐個用加壓球加壓過濾，前處理操作繁瑣、耗時；即使是使用大型的超聲波發生器一次也只能擺放10 個裝有400 mL 水的燒杯，即每個批次最多只能處理10 個樣品；整個前處理過程中樣品均在漏斗中，過濾、除雜時濾孔易被堵塞，導致過濾速度較慢。

為進一步簡化樣品前處理操作，本研究中設計了圖2 所示的樣品萃取瓶。該樣品萃取瓶的外套管可以實現樣品裝載和萃取的功能，內套管可以實現樣品免轉移過濾的功能。采用本裝置，在整個樣品前處理操作過程中不需要轉移樣品，因而樣品前處理過程得到了明顯簡化；另外，超聲萃取前用內套管卡住樣品外套管的口部，避免了超聲萃取過程中可能出現的萃取液濺出或被污染的風險。采用該樣品萃取瓶不僅可以集樣品超聲萃取、萃取液過濾、廢液轉移于一體，而且可以進行大批量樣品前處理操作。此外，使用該樣品萃取瓶進行樣品前處理時，可以有效地避免過濾過程中的篩板堵塞，因而過濾速度較快。

2.2 樣品前處理條件的優化

由于煙草中有多酚、色素、醌類等成分，會干擾淀粉的測定，因此標準方法中采用80%乙醇-氯化鈉飽和溶液超聲萃取30 min［9］以除去樣品中的干擾雜質，而雷諾公司采用75%甲醇-氯化鈉飽和溶液72 ℃萃取30 min［15］的方法。由于標準方法無需加熱，操作更簡便，因此本研究中參考標準方法，選擇在室溫下對樣品進行超聲萃取以脫除雜質。稱取7 份烤煙試樣，各加入25 mL 80%乙醇-氯化鈉飽和溶液，依次超聲5、l0、20、30、40、50 和60 min，以不超聲萃取脫除雜質（0 min）為對照，樣品中的淀粉含量檢測結果見圖3。可以看出，超聲20 min 后，樣品中淀粉含量基本保持不變，表明樣品中的干擾物質已基本去除。為確保雜質完全被去除，本研究中選擇超聲萃取時間為30 min。

圖3 超聲萃取去除雜質時間對淀粉含量的影響Fig.3 Influences of impurity removing time in ultrasonic extraction on starch content

除去樣品中干擾淀粉測定的雜質后，需用高氯酸萃取樣品中的淀粉。雷諾公司采用40%高氯酸在室溫下靜置萃取樣品中的淀粉［7］，而標準方法中采用40%高氯酸超聲萃取煙草中的淀粉［15］，兩種方法的萃取時間均為10 min。本研究中比較了靜置萃取、振蕩萃取和超聲萃取等方法對淀粉的萃取效率，以典型的烤煙樣品為例，分別在室溫下靜置萃取、振蕩萃取和超聲萃取10 min，淀粉含量檢測結果見表1?？梢钥闯?，超聲萃取法的效果略好于靜置萃取和振蕩萃取法，這可能是因為超聲萃取更易使淀粉與小分子化合物通過氫鍵作用相結合，并發生溶脹，從而使淀粉更容易轉移到萃取液中。因此，選擇使用40%高氯酸超聲萃取10 min 的方法。

表1 不同萃取方式對淀粉測定結果的影響Tab.1 Influences of different extraction methods on starch content

2.3 工作曲線

對配制的不同質量濃度的淀粉系列標準工作溶液進行檢測分析，并以淀粉的峰高對其濃度進行線性回歸，得到淀粉的工作曲線。實驗中得到的線性回歸方程為Y = 867.4X + 69.58，相關系數r = 0.999 6。該工作曲線能覆蓋本研究中所有類型煙草樣品的淀粉含量范圍。

2.4 回收率

分別稱取0.250 6 g 直鏈淀粉標準品（99.8%）和1.002 5 g 支鏈淀粉標準品（99.8%）于燒杯中；向直鏈淀粉的燒杯中加入2.0 g 氫氧化鈉，用水煮沸溶解，而支鏈淀粉直接用水煮沸溶解；冷卻后分別轉入50 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，得到回收率實驗用淀粉標準儲備液，其中，直鏈淀粉標準儲備液的質量濃度為5.002 mg/mL，支鏈淀粉標準儲備液的質量濃度為20.010 mg/mL；分別移取直鏈淀粉儲備液和支鏈淀粉儲備液各10 mL 于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，得到回收率實驗用淀粉混合標準儲備液（淀粉混合標準儲備液的質量濃度為5.002 4 mg/mL）。

選擇典型的烤煙、白肋煙和香料煙樣品進行3個不同濃度的加標回收率實驗。在3 組（每組3 個樣品）已加入相同煙草樣品的外套管中分別加入不同量的淀粉標準儲備液，見表2。實驗中，加標量均覆蓋樣品可能的含量范圍。用冷凍干燥機除去加標后的樣品中的水分，然后進行前處理和檢測。由表2 可以看出，方法回收率為96.40%～101.30%，表明本方法較準確。

表2 方法回收率實驗結果Tab.2 Recovery of the method

2.5 精密度

選擇白肋煙、香料煙和烤煙樣品，在同一天內平行測定7 次，計算日內相對標準偏差（RSD）；相同樣品每天測定1 次，連續測定7 d，計算日間相對標準偏差。結果表明：烤煙樣品（淀粉含量3.86%），日內RSD 為0.96%，日間RSD 為1.24%；白肋煙樣品（淀粉含量0.84%），日內RSD 為2.48%，日間RSD 為3.22%；香料煙樣品（淀粉含量2.28%），日內RSD 為1.87%，日間RSD 為2.32%。可見，本方法的再現性較好。

2.6 實際樣品分析結果

采用本方法和標準方法分析云南中煙T0 代基因編輯素材苗期、團棵期、旺長期、成熟期4 個階段的淀粉含量，結果見表3。對兩種方法的檢測結果進行配對t 檢驗，結果P 值為0.712（＞0.05），說明兩種方法的測定值無顯著差異。

表3 顯示，不同成長階段的煙株中淀粉含量不同：苗期淀粉含量較低；團棵期淀粉含量較苗期明顯增加；旺長期與團棵期相比淀粉含量沒有明顯變化；成熟期淀粉含量顯著高于前3 個生長階段。淀粉含量的變化與煙株不同生長階段的特性有關。在苗期，煙株葉面積較小，光合能力較弱，淀粉類光合產物主要滿足煙株生長發育的需要。在團棵期，葉面積增大，光合作用增強，合成的淀粉類產物較多，這些物質除了可以滿足煙株生長發育的需求外，還開始在煙葉中累積?？傮w上，在煙株生長前期，煙葉光合作用產物主要滿足新器官、新組織的形成和生長需要，淀粉等碳水化合物的含量呈緩慢增加的趨勢。在旺長期，營養物質主要供給煙株的生殖生長，淀粉累積速度減緩。在成熟期，煙葉中可溶性總糖和還原糖急劇升高，為淀粉的合成提供了更多碳源，導致淀粉大量累積［16-18］。

表3 本方法與YC/T 216—2013 方法檢測結果的對比Tab.3 Comparison of determination results between the proposed method and the method described in YC/T 216—2013 （%）

3 結論

在標準方法的基礎上設計了一種新型樣品萃取瓶，采用該樣品萃取瓶，不需要樣品轉移操作即可完成樣品的脫除雜質、洗滌和淀粉萃?。欢叶鄠€樣品可放在試管架上進行批量處理。與標準方法相比，本方法的樣品前處理步驟簡單，樣品檢測效率得到了顯著提高。3 個不同添加水平下的回收率為96.40%～101.30%；日內、日間相對標準偏差均小于3.3%。采用本方法與標準方法YC/T 216—2013 的樣品測定結果無明顯差異。本方法為煙草基因編輯素材的淀粉分析提供了一種快速、準確、可靠的高通量方法。