氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測新鮮煙葉中的萜類成分

鄭慶霞，劉萍萍，陳千思，翟 妞，徐國云，張 慧，金立鋒，陳 霞，周會娜

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

萜類成分是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，對植物的生長發(fā)育以及抵御外界侵害［1-2］等具有重要的作用。煙草中的萜類成分除了具有調(diào)節(jié)煙草生長、增強抗逆性等生理功能外［3］，還與煙草香氣品質(zhì)密切相關(guān)［4-5］，是衡量煙草品質(zhì)的重要指標(biāo)。因此，準(zhǔn)確檢測煙草中萜類成分的含量是研究萜類成分代謝途徑、提高萜類成分含量、解析煙草香氣品質(zhì)的重要前提。

國內(nèi)外用于萜類成分檢測的方法主要有紫外分光光度法［6］、高效液相色譜法［7］、氣相色譜法（GC）［8］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）［9-10］及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）［11］等。紫外分光光度法主要用于測定萜類成分總量，而對于萜類成分的快速分離和檢測，色譜法具有顯著優(yōu)勢。高效液相色譜法的分離效果好且分析速度快，適用于分析極性及難揮發(fā)性成分；氣相色譜法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，適用于分析非極性、弱極性或易揮發(fā)性成分；二者在萜類成分的含量測定方面應(yīng)用廣泛。近年來，GC-MS［12-13］和LC-MS［14-15］在煙草萜類成分分析中扮演著越來越重要的角色。通常，LC-MS 法不需要衍生化，但離子抑制（基質(zhì)效應(yīng)）明顯，使方法靈敏度受到一定的影響；GC-MS/MS 法的選擇性好、靈敏度高，且對復(fù)雜基質(zhì)的抗干擾能力強［16］，因而在一些微/痕量萜類成分的分析中應(yīng)用廣泛。

目前，煙草萜類成分的含量研究中主要采用GC-MS 技術(shù)，研究對象主要是烤后煙葉、卷煙煙氣等，而有關(guān)新鮮煙葉中萜類物質(zhì)的含量研究較少，且往往局限于甾醇［17］、西柏烷二萜醇［18］等幾種萜類成分，其他一些與煙草感官品質(zhì)有關(guān)的重要二萜類成分如賴百當(dāng)二萜類成分的研究鮮見報道，目標(biāo)物的覆蓋面較窄。研究新鮮煙葉中萜類成分的含量變化可以更準(zhǔn)確地分析氣候、海拔等生態(tài)因素對煙葉生長發(fā)育的影響，明確各個萜類成分在生育期的累積規(guī)律，能夠為下一步關(guān)鍵調(diào)控機理和有效調(diào)控手段的研究奠定基礎(chǔ)。基于此，建立新鮮煙葉中倍半萜、二萜、甾醇等21 種萜類成分的GC-MS/MS 檢測方法，旨在為煙葉中多種萜類成分的準(zhǔn)確定量分析提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

采摘河南、云南及貴州3 個省份12 個縣市共9個煙草品種的成熟期第10 葉位煙葉，樣品信息見表1。本批新鮮煙葉樣品共72 份（煙葉樣品品種及產(chǎn)區(qū)見表1，每份煙葉樣品采用6 個生物學(xué)重復(fù)）。所有煙葉樣品采摘后在液氮中速凍，并在干冰包埋下送至實驗室中進(jìn)行真空冷凍干燥，研磨成粉末后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 煙葉樣品信息Tab.1 Information of tobacco samples

二氯甲烷（色譜純，德國Merck 公司）；萜類標(biāo)準(zhǔn) 品 中（1S,2E,4S,6R,7E,11E）-2,7,11- 西 柏 烷 三烯-4,6-二醇、（1S,2E,4R,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、順冷杉醇和賴百當(dāng)-13-烯-8,15-二醇為實驗室自制，經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測（GC-MS/MS）檢測，其純度≥98%；其他標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma-Aldrich 公司。

Trace 1310GC 氣相色譜儀（配AI 1310 自動進(jìn)樣器）、TSQ8000 質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.，美國Agilent 公司）；KQ-700DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-EVAPTM112 型氮吹儀（美國Organomation 公司）；BSA2245-CW 型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius 公司）；MX-S 型漩渦混勻器（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；5424 型臺式高速離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)萃取液：以二氯甲烷為溶劑，配制質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1的十三烷酸內(nèi)標(biāo)萃取液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取適量21 種萜類成分標(biāo)準(zhǔn)品，用內(nèi)標(biāo)萃取液溶解，稀釋后配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用內(nèi)標(biāo)萃取液稀釋配制成系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品預(yù)處理與分析

準(zhǔn)確稱取新鮮煙葉凍干粉末20 mg 于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 內(nèi)標(biāo)萃取液（含內(nèi)標(biāo)十三烷酸2.5 mg·L-1），渦旋6 s 后室溫超聲提取60 min；將提取液靜置，并于120 000 r·min-1下離心12 min；取800 μL 上清液至1.5 mL 樣品瓶中，用氮氣吹干；加入200 μL 衍生化試劑（BSTFA/DMF，體積比1∶1）［19］，70 ℃下反應(yīng)60 min；進(jìn)樣分析。GC-MS/MS 分析條件為：

進(jìn)樣方式：恒流模式，分流比20∶1；進(jìn)樣量：1.0 μL；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；載氣及流速：氦氣（99.999%），1.0 mL·min-1；升溫程序：初始溫度80 ℃，以20 ℃·min-1升至215 ℃，再以0.5 ℃·min-1升至220 ℃，最后以15 ℃·min-1升至310 ℃并保持15 min；電離方式：電子轟擊（EI）；電離能量：70 eV；溶劑延遲：7 min；傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：250 ℃；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（Selective Reaction Monitoring，SRM）。21 種萜類成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific）的Xcalibur 定量軟件對煙葉中的各個萜類成分進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法和歸一化法定量分析。采用SIMCA 15.0（Umetrics Sweden）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），利用t檢驗篩選差異性成分（P＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

二氯甲烷、氯仿和己烷能夠與大部分萜類物質(zhì)良好共溶，是萜類物質(zhì)的優(yōu)良提取溶劑［18,20-21］。甲醇、乙腈等對大部分的次生代謝產(chǎn)物如多酚、酯類化合物等具有良好的溶解性能。因此，本實驗中分別考察了二氯甲烷、氯仿、正己烷、甲醇和乙腈對煙葉中萜類成分的提取效率，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比進(jìn)行比較，如圖1 所示。由圖1 可以看出，二氯甲烷的提取效果優(yōu)于其他4 種溶劑，因此選擇二氯甲烷作為提取溶劑。圖2 為經(jīng)二氯甲烷提取后煙葉中萜類成分的GC-MS 色譜圖。由圖2 可以看出，在優(yōu)化條件下，煙葉中萜類成分的色譜分離效果較好。

表2 21 種萜類成分及內(nèi)標(biāo)的GC-MS/MS 分析的保留時間、特征離子及碰撞能量Tab.2 Retention time, quantitative and collision energies of 21 terpenoids and internal standard by GC-MS/MS

圖1 不同提取試劑對21 種萜類成分檢測結(jié)果的影響Fig.1 Effects of solvents on determination results of terpenoids

圖2 新鮮煙葉萜類物質(zhì)成分的TIC 圖(以河南許昌產(chǎn)區(qū)的豫煙10 號樣品為例)Fig.2 Total ion chromatogram of terpenoids in fresh tobacco (cv. Yuyan No.10 from Xuchang in Henan Province) detected by GC-MS/MS

2.2 方法驗證

2.2.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

取1.2 節(jié)所配制的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，用氮氣吹干，加入200 μL 衍生化試劑（BSTFA/DMF，體積比1 ∶1），70 ℃下反應(yīng)60 min 后進(jìn)行GC-MS/MS 分析。以各目標(biāo)物定量離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)定量離子色譜峰面積的比值對目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度的比值進(jìn)行線性回歸分析，各目標(biāo)物的線性回歸方程及其決定系數(shù)見表3。可見，在一定的濃度范圍內(nèi)，各萜類標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與相對峰面積具有良好的線性相關(guān)性，R2均大于0.999。

采用稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法測定每種萜類物質(zhì)的檢出限（以3 倍信噪比確定檢出限）和定量限（以10 倍信噪比確定定量限），結(jié)果見表3。由表3 可知，各萜類標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限較低，為12.7～308.7 ng·mL-1。

2.2.2 方法重復(fù)性、儀器精密度及樣品穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取6 份新鮮煙葉粉末樣品進(jìn)行平行處理，測定方法重復(fù)性；選擇其中1 份試樣連續(xù)進(jìn)樣8 針檢測儀器的日內(nèi)精密度，將該試樣每天連續(xù)進(jìn)樣8 針并重復(fù)4 d 來檢測儀器的日間精密度；另取1 份試樣分別于衍生后0、12、24、48、72 h 進(jìn)樣，檢測樣品在常溫條件下72 h 內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果見表4。可見，本方法呈現(xiàn)良好的重復(fù)性（RSD為0.92%～13.45%）和日內(nèi)、日間精密度（RSD 分別為0.19%～8.28%、1.02%～9.35%）。此外，樣品在72 h 內(nèi)呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性（RSD 為1.44%～10.72%）。

表3 21 種萜類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、決定系數(shù)、線性范圍及檢出限(LOD)、定量限(LOQ)Tab.3 Standard curves, determination coefficients, linear ranges, detection limits, quantitation limits of the 21 terpenoids

表4 GC-MS/MS 檢測新鮮煙葉中21 種萜類成分的方法重復(fù)性、日內(nèi)、日間精密度和樣品穩(wěn)定性Tab.4 Method repeatability, intra-day precision,inter-day precision and sample stabilities of the 21 terpenoids in fresh tobacco detected by GS-MS/MS

2.2.3 回收率

用新鮮煙葉粉末作為基質(zhì)，選取高中低3 個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，每個水平重復(fù)3 次，結(jié)果見表5。可以看出，21 種萜類物質(zhì)的加標(biāo)回收率在89.6%～118.7%之間，RSD 在0.19%～3.15%之間，說明本方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

2.3 實際樣品分析結(jié)果

采用本方法對云南、河南及貴州3 個產(chǎn)區(qū)的成熟期新鮮煙葉樣品進(jìn)行了分析，圖3 為3 個產(chǎn)區(qū)新鮮煙葉中21 種萜類成分含量的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）得分圖。由圖3 可以看出，在萜類成分含量方面，3 個產(chǎn)區(qū)間具有明顯的分離趨勢，說明3 個產(chǎn)區(qū)間的萜類成分含量具有明顯差異，且貴州產(chǎn)區(qū)的萜類成分含量分布較云南和河南產(chǎn)區(qū)差異更大，遵義產(chǎn)區(qū)的南江3 號煙葉中的萜類成分含量與其他3 個品種差異明顯。

應(yīng)用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）對3 個產(chǎn)區(qū)煙葉中的萜類成分含量進(jìn)行兩兩比較，并保留OPLS-DA 模型中VIP（Variable importance in the projection，變量重要性）值大于1 且非參數(shù)檢驗呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）的萜類成分，3 組結(jié)果取并集后得到3 個產(chǎn)區(qū)的差異成分。結(jié)果顯示，α-CBD、角鯊烯、β-植醇、豆甾醇、膽固醇、菜油甾醇和β-谷甾醇是3 個產(chǎn)區(qū)的差異成分。α-CBD 是煙葉表面物質(zhì)的主要成分，在調(diào)制、醇化以及燃燒過程中容易發(fā)生氧化降解產(chǎn)生多種降解產(chǎn)物如茄酮、茄醇和降茄二醇［4］等，并且與人體感官關(guān)系密切［22］。此外，α-CBD 與昆蟲和微生物之間有互動性，具有較高的殺蟲和殺菌活性［23］。由圖4 可知，3 個產(chǎn)區(qū)煙葉中α-CBD 含量順序為云南＞河南＞貴州，且相互之間均存在顯著性差異。貴州產(chǎn)區(qū)中，南江3 號的α-CBD（13.35 μg·g-1）低于其他品種，與吳云平等［24］、朱顯靈等［25］的研究結(jié)果一致，說明煙葉萜類成分差異可能由品種自身的遺傳組成和生態(tài)因素綜合決定。

表5 21 種萜類成分的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.5 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 21 terpenoids （%）

圖3 3 個產(chǎn)區(qū)的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)得分圖(R2X=0.261,R2Y=0.498,Q2=0.369)Fig.3 Partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)score scatter plot of three origins(R2X=0.261,R2Y=0.498,Q2=0.369)

圖4 不同產(chǎn)區(qū)及品種之間的α-CBD 含量比較Fig.4 Comparison of content of α-CBD between different origins and different cultivars

3 結(jié)論

針對煙葉中存在的萜類物質(zhì)，建立了基于GC-MS/MS 的定量分析方法，實現(xiàn)了煙葉中21 種萜類成分的快速檢測及分析。在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)工作曲線線性良好，方法的重復(fù)性、日內(nèi)、日間精密度及穩(wěn)定性較好；加標(biāo)法測定的低中高水平線的回收率等均滿足實驗要求。采用此方法對云南、河南和貴州3 個產(chǎn)區(qū)的成熟新鮮煙葉進(jìn)行了分析，除麥角甾醇外，其他20 種萜類均可穩(wěn)定測得。其中，（1S,2E,4S,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇、角鯊烯、β-植醇、豆甾醇、膽固醇、菜油甾醇和β-谷甾醇是3 個產(chǎn)區(qū)的差異成分，（1S,2E,4R,6R,7E,11E）-2,7,11-西柏烷三烯-4,6-二醇含量高低順序為云南（98.83 μg·g-1）＞河南（57.04 μg·g-1）＞貴州（38.61 μg·g-1），且產(chǎn)區(qū)之間存在顯著性差異。本方法適用于煙葉中萜類物質(zhì)的測定。