膜分離技術精制羅漢果香味成分及應用

吳 彥，俞金偉，黃東業，馬擴彥，曲利利，冉盼盼，孟丹丹，許春平*

1. 廣西中煙工業有限責任公司技術中心，南寧市北湖南路28 號 530001

2. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術開發區科學大道136 號 450001

3. 重慶中煙工業有限責任公司技術研發中心，重慶市南岸區南坪東路2 號 400060

羅漢果（Siraitia grosvenorii）為葫蘆科羅漢果屬植物，是我國特有的藥用植物。羅漢果營養價值高，其干果富含蛋白質、多種氨基酸和維生素C；其味甘性涼，清甜醇香，被衛生部列為既是食品又是藥品的產品［1］。目前，已有學者對羅漢果中的甜苷、羅漢果黃酮、塊根藥用成分［2-3］及其種仁油脂［4-5］進行了研究。鄭小嘎等［6］采用索氏提取法制備羅漢果浸膏并進行卷煙加香試驗，結果表明，羅漢果浸膏具有明顯降低卷煙刺激性、柔和煙香、改善口感和增加煙氣甜潤度等效果。然而，提取的天然香料粗提物中不可避免地帶有蛋白質、淀粉、蠟質等物質，這些大分子物質會對卷煙的感官品質產生不良影響［7-8］。

膜分離技術是一種選擇性分離技術，可在分子水平上實現不同粒徑分子混合物的分離［9］。王娜等［10］利用膜分離技術分離純化桂花提取物，結果表明，膜分離技術可在保留桂花提取物原有特色香味的同時，有效去除對煙氣感官質量有負面影響的大分子物質，從而達到提高桂花提取物品質的目的。杜銳等［11］研究了膜分離技術在提高再造煙葉品質方面的應用效果，結果表明：經過膜分離技術處理的煙梗、煙末萃取液中的總氮分別下降62.5%和67.8%；果膠基本去除；利用處理后的煙梗和煙末萃取液制備的再造煙葉的感官品質均有提升。目前，利用膜分離技術分離羅漢果浸膏制備煙用香料的研究鮮見報道。因此，采用索氏提取方法提取羅漢果天然成分，選用膜分離技術對制備的羅漢果浸膏進行分離、提純，并將精制的天然香料組分添加到卷煙中，考察其加香效果；同時，采用GC/MS 分析各個組分的揮發性成分并進行主成分分析，再對膜分離組分加香的卷煙煙氣粒相物中的揮發性成分進行分析，旨在為天然香料開發及卷煙加香應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羅漢果（購自廣西壯族自治區桂林市）；空白卷煙（廣西中煙工業有限責任公司技術中心提供）。

無水乙醇（AR，天津市富宇化工有限公司）；內標：乙酸苯乙酯（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）。

Q-100A3 高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；陶瓷膜小型試驗機、有機膜小型試驗機（濟南博納生物技術有限公司）；Agilent 6890/5973 氣 質 聯 用 儀（GC/MS，美 國Agilent 公司）；RM20H 20孔道轉盤型吸煙機（德國Borgwalt-KC公司）。

1.2 方法

1.2.1 羅漢果浸膏制備

根據預實驗，準確稱取100.00 g 羅漢果粉，用濾紙包好后裝入索氏提取器，加入500 mL 無水乙醇，加熱回流2 h；過濾，將濾液減壓蒸餾至無乙醇流出，得到羅漢果浸膏23.74 g。

1.2.2 羅漢果浸膏膜分離及卷煙加香試驗

準確稱取10.00 g 羅漢果浸膏于1 000 mL 燒杯中，加入500 mL 20%乙醇；浸膏完全溶解后，進行膜分離實驗（圖1）。工藝流程：將未進行膜分離實驗的組分記為M1；使用50 nm陶瓷膜去除固形顆粒雜質，截留組分記為M2，得到1.92 g組分；對透過液進行100 kDa 有機膜分離，截留組分記為M3，得到2.55 g組分；透過組分記為M4，得到1.69 g組分。

圖1 膜分離實驗工藝流程Fig.1 Process flow of membrane separation experiments

1.2.3 羅漢果浸膏膜分離組分煙絲加香試驗

按照煙絲質量0.2 %的用量計算和稱取組分，將稱取的各組分用5 mL 70%乙醇溶解，然后均勻噴灑到煙絲上；將加香煙絲平衡，然后卷制成卷煙；將卷煙樣品在溫度22 ℃、相對濕度60%的環境條件下平衡48 h，然后進行感官評吸。

1.2.4 羅漢果浸膏膜分離組分中揮發性成分分析

準確稱取M1～M4 組分各1.00 g 于分液漏斗中，分別加入20 mL 20%乙醇振蕩溶解，待溶解完全后加入20 mL 二氯甲烷萃取24 h。取下清液，加入適量無水硫酸鈉，靜置過夜。過濾，將濾液濃縮至1 mL，以乙苯乙酯作為內標，進行GC/MS 分析。采用面積歸一化法測定揮發性粒相物的釋放量。GC/MS 條件為：

色譜柱：HP-5MS 毛細管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，維持3 min，以4 ℃/min 升溫至260 ℃，維持5 min；汽化溫度：270 ℃；載氣：He，1 mL/min；分流比：5∶1；電離方式：電子轟擊（EI）；檢測器溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；質量掃描范圍：30～700 amu；檢索譜庫：NIST11 譜庫。

1.2.5 羅漢果浸膏膜分離組分主成分分析

利用SPSS 軟件進行主成分分析，根據相關系數列出相關矩陣，求出特征值及其相應的特征向量，從特征根中選出幾個較大的特征值及其特征向量，使其累積貢獻率在80%以上。

1.2.6 羅漢果浸膏膜分離組分卷煙加香驗證

根據1.2.3 節感官評吸結果，進行卷煙加香試驗。制備試驗卷煙40 支和空白卷煙40 支，在溫度（22±1）℃、相對濕度（60±2）%的環境條件下平衡48 h 后進行吸煙機抽吸實驗。吸煙機實驗條件：抽吸容量35 mL，抽吸持續時間2 s，抽吸間隔58 s。按照GB/T 19609—2004 標準的要求，用劍橋濾片捕集卷煙煙氣粒相物，各收集40 支卷煙的粒相物。對劍橋濾片進行同時蒸餾萃取，采用GC/MS分析煙氣粒相物中的揮發性成分，GC/MS 上樣條件同1.2.4。將試驗卷煙和空白卷煙的分析結果進行對比分析。

2 結果與討論

2.1 膜分離組分卷煙加香感官評吸

膜分離組分的感官評吸結果見表1。可以看出，M3 組分的感官評吸結果最佳，能增加卷煙香氣，使煙氣柔和、刺激性減小，還可提高余味舒適度。M1 為醇提羅漢果浸膏，其中含有蛋白質、淀粉、蠟質等成分，這些成分會影響卷煙的感官品質；M2 是50 nm 陶瓷膜截留組分，其中也含有一定量的蛋白質、淀粉、蠟質等成分，因而也會影響加香效果；M3 是100 kDa 有機膜截留組分，其中的蛋白質、淀粉、蠟質等大分子物質已被前一步處理中使用的50 nm 陶瓷膜截留，而且香味物質含量豐富，因而其感官評吸效果最佳；M4 是100 kDa 有機膜透過組分，其中的香味物質量較少，因而其加香效果不佳。

表1 膜分離組分的感官評吸結果Tab.1 Sensory evaluation results of membrane separation components

2.2 膜分離組分揮發性成分分析

采用峰面積歸一化法測定揮發性成分含量，4個組分中共檢出43 種揮發性成分，結果見表2。由表2 可知：M1 中共檢測出29 種揮發性成分，總量為3 573.66 μg/g，主要包括亞油酸、反式角鯊烯、5-羥甲基糠醛、油酸酰胺、棕櫚酸等；M2 中共檢測出18 種成分，總量為1 593.72 μg/g，主要包括5-羥甲基糠醛、亞油酸、油酸酰胺等；M3 中共檢測出24種成分，總量為2 585.41 μg/g，主要包括金合歡醇、油酸酰胺、5-羥甲基糠醛、δ-杜松烯等；M4 中共檢測出8 種成分，總量為954.51 μg/g，主要包括亞油酸、油酸酰胺、5-羥甲基糠醛等。

5-羥甲基糠醛具有似焦糖、谷物烘烤氣息，有果香、面包香，可賦予卷煙木香、花香、果香和甜香；反式角鯊烯是煙葉中非色素的萜烯類物質，既能增進煙葉的香氣和吸味，又可通過降解轉化形成致香成分；金合歡醇［12］具有特有的鈴蘭花香氣，并有青香和木香香韻，可賦予卷煙花香、青香和木香香韻；順-β-金合歡烯具有青香、花香并伴有香脂香氣。與M1 組分相比，除烷烴外，M2、M3、M4組分中揮發性成分的種類減少，含量也有不同程度的減少，這可能是由于膜吸附造成香味物質損失所致。與M1 組分相比，從M2、M3、M4 組分中檢測出金合歡醇、2,4-二叔丁基苯酚、δ-杜松烯、順-β-金合歡烯等成分，原因可能是M1 組分中物質種類較多，且這些物質與某些含量高的物質的保留時間相近，其色譜峰被高含量物質所掩蓋，導致M1 中未檢測出這些物質。

2.3 膜分離組分主成分分析

利用SPSS 軟件對4 個組分中揮發性成分的相對含量進行主成分分析，得到主成分的特征值和特征向量（表3）。由表3 可知，第1 成分的貢獻率為59.126%，第2 成分的貢獻率為26.353%，前兩個成分的累積貢獻率已超過80%。可見，這兩個主成分足以說明檢測數據的變化趨勢，因此根據其貢獻大小將其分別命名為第1、第2 主成分。

表2 膜分離組分揮發性成分及含量①Tab.2 Volatile components and their contents in membrane separation components

表3 2 個主成分的貢獻率Tab.3 Contributions of the two principal components

M1～M4 組分中檢測出的43 種揮發性成分的主成分載荷矩陣如表4 所示。由表4 可知：第1 主成分反映的指標主要有棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、異丁香酚、反式角鯊烯、亞油酸甲酯、芥酸酰胺、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯、棕櫚酸乙酯，十七烷、二十九烷、2,6,10,14-四甲基十六烷、2-乙酰基吡咯、環十二炔、亞麻酸乙酯、2-哌啶乙醇，指向酸類、酯類物質和烷烴；第2 主成分反映的指標主要有S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、二十一烷、二十六烷、二十八烷、二十三烷、（5 α）-4,4-二甲基-膽甾烷-3-酮、金合歡醇、δ-杜松烯、順-β-金合歡烯、1-羥基-1,7-二甲基-4-異丙基-2,7-環癸二烯，指向烷烴和烯類物質。

表4 主成分載荷矩陣Tab.4 Principal component load matrix

根據表2 中4 個組分的43 種香氣成分的相對含量，表3 中兩個主成分的特征值，以及表4 中43種香氣成分的載荷值，計算4 個組分的第1、第2 主成分值，然后以第1 主成分值為橫坐標、第2 主成分值為縱坐標作散點圖（圖2）。由圖2 可知，根據距離遠近4 個組分可分為3 個區域，其中M2 組分與M4 組分接近，而M1 組分與M3 組分相距較遠，即M2 組分和M4 組分的主成分有一定程度的相似性，而M1 和M3 組分的主成分差異較大。

圖2 膜分離組分的主成分散點圖Fig.2 Main component dispersion point diagram of membrane separation components

以43 種香氣成分的第1 主成分值為橫坐標、第2 主成分值為縱坐標作散點圖，如圖3 所示。結合圖2 和圖3 可知：影響M1 組分香氣組成的揮發性成分主要集中在第1 主成分的正半軸和第2 主成分的負半軸，按影響力從大到小依次為亞油酸、反式角鯊烯、異丁香酚、DEHA 和亞油酸乙酯；影響M3 組分香氣組成的揮發性成分主要集中在第1主成分的負半軸和第2 主成分的正半軸，按影響力從大到小依次為二十六烷、二十三烷、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、二十一烷、油酸酰胺、二十四烷、六氫-3-（2-甲基丙基）-吡咯并［1,2-a］吡嗪-1,4-二酮和棕櫚酰胺；影響M2 和M4 組分香氣組成的揮發性成分主要集中在第1 主成分的負半軸和第2 主成分的負半軸，按影響力從大到小依次為4-戊基-1-（4-丙基環己基）-環己烯、硬脂酰胺、2,4-二叔丁基苯酚和二十烷。

2.4 膜分離組分加香后煙氣粒相物揮發性成分分析

將M3 組分添加到卷煙中，作為實驗組，分析其煙氣粒相物揮發性成分并與對照組比對，選取匹配度大于80%的成分，結果如表5 所示。由表5可知，從空白對照組共檢測出83 種成分，總量為16 764 μg/g；從實驗組共檢測出78 種成分，總量為17 427 μg/g。與對照組相比，添加M3 組分的實驗組中烷烴和苯系化合物的種類及釋放量均顯著降低，這可能是因為在卷煙抽吸過程中M3 組分中的某些化學物質和這些物質發生化學反應生成其他化合物，進而導致烷烴和苯系化合物的釋放量降低［13］。苯系化合物不僅影響卷煙感官質量，而且對人體健康有潛在的危害［14-16］。由此可知，M3 組分對提高卷煙安全性有積極作用。

對實驗組和空白對照組揮發性成分進行進一步分析，結果顯示，除煙堿、烷烴和苯系化合物外，空白對照組揮發性成分總量為9 676.09 μg/g，實驗組揮發性成分總量為11 393.74 μg/g，揮發性成分總量增加1717.65 μg/g。烷烴物質總釋放量降低164.56 μg/g，降幅高達84.4%；苯系化合物總釋放量降低781.09 μg/g，降幅達到39.4%。實驗組中釋放量增加的揮發性成分有2,5-二甲基吲哚、香葉基香葉醇、二氫香芹醇、檸檬烯、香樹烯、（+）-4-蒈烯等，這些成分對卷煙的香氣和吸味均有積極作用。例如：2,5-二甲基吲哚可賦予卷煙烘烤氣息；香葉基香葉醇是萜類成分、胡蘿卜素等多種產物的前體；二氫香芹醇具有留蘭香氣、胡椒辛辣味；檸檬烯是單萜類化合物，具有類似檸檬的香味；香樹烯和（+）-4-蒈烯是柏木油中主要的化學成分，具有柏木或檀香香氣。

圖3 43 種揮發性成分的主成分散點圖Fig.3 Main component dispersion point diagram of 43 kinds of volatile components

表5 卷煙煙氣粒相物揮發性成分檢測結果對比①Tab.5 Comparison of detection results of volatile components in particulate matters of mainstream cigarette smoke

表5 （續）

表5 （續）

3 結論

①羅漢果浸膏經膜分離共分為M1、M2、M3、M4 四個組分，感官評吸結果表明，M3 組分的感官評吸效果最佳，煙絲中加入M3 組分后卷煙煙氣更加柔和，刺激性降低，余味舒適。②經GC/MS 分析，從4 個組分共檢測出43 種成分，其中某些成分如5-羥甲基糠醛、異丁香酚、反式角鯊烯、α-法尼烯、金合歡醇、順-β-金合歡烯等為煙葉中重要的香氣成分。③對4 個組分進行主成分分析，發現M3 組分與M1、M2、M4 有顯著差異；M2 和M4 組分的香味成分無顯著差異。M3 組分中的香氣成分主要有二十六烷、二十三烷、α-法尼烯、（E,E）-3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯醛、S-（Z）-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇、二十一烷、油酸酰胺、二十四烷、六氫-3-（2-甲基丙基）-吡咯并［1,2-a］吡嗪-1,4-二酮和棕櫚酰胺等。④利用吸煙機收集試驗卷煙煙氣粒相物，揮發性成分檢測結果表明，M3 組分使卷煙煙氣粒相物中苯系化合物的釋放量降低，這對卷煙的安全性有積極作用。