復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病和根際土壤微生物群落功能多樣性的影響

張 維，刁朝強，李 斌，包自超，張家韜，林北森，陳德鑫*

1. 中國農業科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區科苑經四路11 號 266100

2. 貴州省煙草公司貴陽市公司，貴陽市南明區華坤大廈 550001

3. 中國煙草總公司四川省公司，成都市高新區世紀城路936 號 610041

4. 中國煙草總公司山東省公司，濟南市高新區龍奧北路1067 號 250101

5. 中國煙草總公司陜西省公司，西安市雁塔區雁南四路19 號 710000

6. 中國煙草總公司海南省公司，?？谑协偵絽^紅城湖路22 號 571199

煙草黑脛病（Tobacco black shack）是由寄生疫霉（Phytophthora parasitica var. nicotiana）引起的一種毀滅性土傳病害，每年給煙草生產造成巨大的經濟損失［1］。目前，煙草黑脛病的防治主要以化學防治為主，但長期施用農藥造成的污染問題，對煙草安全及人類健康都存在直接或間接的危害［2］。生物防治作為一種新型的病害防治措施，不僅對植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生產中存在的農藥殘留和病菌抗藥性問題［3-4］。周京龍等［5］研究表明，生防菌不僅對土傳病害的病原菌具有抑制作用，而且可以誘導植株產生抗病性，增強自身免疫力。楊秀榮等［6］利用生防細菌B579 處理黃瓜種子后，黃瓜立枯病得到有效控制，并促進了黃瓜生長。目前，利用生防細菌防治煙草黑脛病也取得了一定的成效。徐同偉等［7］發現從土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）YBM-4 菌株，對煙草黑脛病菌具有較強的拮抗作用。楊藝煒等［8］研究發現，菌株XF10 的發酵液及其揮發性代謝產物能較好地抑制煙草黑脛病菌的生長。然而，單一生防細菌的藥效期短、作用對象單一、易受自然環境影響、競爭存活能力有限且在田間的穩定性差。郭橋燕［9］研究表明，復配拮抗菌對煙草黑脛病的防治效果遠高于單一菌株。為此，利用盆栽試驗和Biolog-ECO 技術，探究了復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病的防治效果，并分析了復配拮抗菌FP246 對根際土壤微生物群落多樣性的影響，旨在為復配生防菌在煙葉生產中防治黑脛病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為紅花大金元，由中國農業科學院煙草研究所提供。盆栽試驗所用土壤取自中國農業科學院煙草研究所即墨基地，該土壤未施用過供試菌劑。

供試菌劑：復配拮抗菌FP246［由沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）YJC-4、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CY106 和CY111 組成，在中國農業科學院煙草研究所分離獲得］，10 億個/g 枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（濰坊萬勝生物農藥有限公司），58%甲霜錳鋅可濕性粉劑（陜西省西安市植豐農藥廠）。

儀器：R71MHD15ZH 電子天平（感量0.1 g，常州奧豪斯儀器有限公司）、Multiskan GO 1510 酶標儀（美國Thermo 公司）、Eppendorf Minispin 離心機（德國Eppendorf 公司）、Biolog 微生物鑒定系統（型號GEN ⅢMicroStation，美國BioTek 公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

煙苗種植于中國農業科學院煙草研究所人工氣候室（溫度28 ℃，相對濕度60%），待煙苗生長至5～6 片真葉時進行移栽。共設4 個處理：T1 處理為復配拮抗菌FP246 菌液（OD600=0.10±0.02）；T2處理為10 億個/g 枯草芽孢桿菌粉劑（2 mg/mL）；T3 處理為58%甲霜錳鋅可濕性粉劑（3 mg/mL）；T4 處理為等量清水，即空白對照。每個處理3 次重復，每個重復20 株煙苗。

煙苗移栽后7 d 開始施用藥劑，每株灌根20 mL，每隔7 d 施用1 次，共施用3 次。在施藥后第23 天，用手術刀在煙苗莖基部刮一傷口，深度至髓部，將煙草黑脛病菌菌餅貼于傷口處，并用脫脂棉保濕［10］。

1.2.2 調查及計算方法

參照標準GB/T 23222—2008［11］方法，在接種黑脛病菌后7 d 調查對照組和處理組的發病率和病情指數，并計算相對防治效果。

發病率=（發病株數/調查總株數）×100%

病情指數=［∑（各級病株或葉數×該病級值）/（調查總株數或葉數×最高級值）］×100

相對防治效果=［（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數］×100%

1.2.3 Biolog-ECO 微生物群落功能多樣性分析

1.2.3.1 土壤樣品采集

第一，對“集合”概念的認識存在偏差.“集合”是不定義的概念，只要學生感知，明白是什么就可以.不必深究它的內涵，這也是教科書本節內容標題為“集合的含義及其表示”而非“集合的概念及其表示”的用意.教科書在習題中給出的“閱讀題”有這樣的敘述：一位漁民非常喜歡數學，但他怎么也想不明白集合的意義.于是，他請教數學家：“尊敬的先生，請你告訴我，集合是什么？”集合是不定義概念，數學家很難回答那位漁民.有一天，他來到漁民的船上，看到漁民撒下魚網，輕輕一拉，許多魚蝦在網中跳動.數學家非常激動，高興地告訴漁民：“這就是集合！”[1]

當對照組發病率達到50%時，采用多點混合法隨機收集土壤樣品［12］。小心挖出育苗盆中整株煙苗，抖掉根系外圍土保留根際土，同時去除根系雜物，經室內自然風干后過1 mm 篩。隨后土樣保存于-80 ℃冰箱，用于Biolog 微生物鑒定分析。

1.2.3.2 Biolog-ECO 微平板接種

ECO 接種液制備方法：①供試土樣在室溫下活化24 h 后，取10 g 土樣于100 mL 無菌三角瓶，加45 mL 無菌水。置于28 ℃振蕩培養箱（180 r/min）培養30 min 后，取1 mL 泥漿于1.5 mL 離心管中。②10 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，加1 mL 無菌生理鹽水（0.85% NaCl）在振蕩器上混勻5 min（此步驟重復3 次，以除去碳源）；棄去上清液，加1 mL 無菌生理鹽水，在振蕩器上振動5 min使之混勻，2 000 r/min 離心1 min。③取上清液加入裝有生理鹽水的試管中，使其OD590=0.13±0.02。④在Biolog-ECO 微平板每個樣品孔中加150 μL 接種液，每個樣品重復3 次。 將接種好的Biolog-ECO 微平板用自封袋裝好，置于28 ℃恒溫箱中培養。分別于0、12、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 用Biolog 微平板讀數儀測定吸光度。

1.2.3.3 多樣性指數計算方法

微生物代謝強度采用每孔平均顏色變化率（AWCD）進行描述［13］。土壤微生物群落代謝多樣性指數選取Shannon-Wiener 指數、Simpson 優勢度指數、McIntosh 指數、豐富度指數進行表征［14-17］。

式中：Ci為第i 個非對照孔吸光值；R 為對照孔吸光值；N 為培養基碳源種類數。

式中：Pi表示第i 個非對照孔中的吸光值與所有非對照孔吸光值總和的比值，即Pi=（Ci-R）/∑（Ci-R）。

式中：ni是第i 個孔的相對吸光值（Ci-R）。

豐富度指數（S）指被利用的碳源總數目，即每孔（Ci-R）的值大于0.25 的孔數。

1.2.4 主成分分析（PCA）

Biolog-ECO 微平板由空白對照孔及31 種單一碳源孔組成，微生物通過每孔吸光值變化度來反映碳源的代謝特征。但這種多元的特征向量不易比較微生物間的代謝差異，因此利用SPSS 軟件將復配拮抗菌FP246 在不同培養時間下的每種碳源吸光值，通過降維的方式將多元特征向量吸光值變成2 個無關的主元向量PC1 和PC2，在二維空間比較不同微生物間的代謝差異。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數據處理，多樣性指數及主成分分析采用240 h 土壤AWCD 值進行計算［18］，繪圖使用Origin 2018 軟件。

2 結果

2.1 復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病的盆栽防治效果

由表1 可知，T1 處理煙草黑脛病的發病率為21.67%，與T3 處理差異不顯著，與T2 及T4 處理差異顯著。T1 處理煙草黑脛病的病情指數為9.45，與對照T4 處理差異顯著。T1 處理的防治效果為85.40%，略低于T3 處理，但優于T2 處理。盆栽防效試驗表明，復配拮抗菌FP246 對煙草黑脛病具有較好的防治效果且高于單一拮抗菌YJC-4［7］。

表1 不同處理下煙草黑脛病的盆栽防治效果①Tab.1 Control efficacies of different treatments on tobacco black shank in pot experiment

2.2 不同接種時間微生物代謝功能的AWCD 變化特征及主成分分析

由圖1 可知，隨著接種時間的增加，AWCD 值呈S 型變化趨勢。各個處理在0～24 h 的時間范圍內不具有統計學意義。接種24 h 后，4 個處理AWCD 值的曲線斜率變大，在168 h 后趨于平穩。比較各處理間AWCD 的最大值發現：T3＞T1＞T2＞T4，其中T3 處理與T1 處理之間的差值較小，但二者均與T2 處理間存在明顯差異。此外，清水對照T4 處理的AWCD 最大值顯著低于其他3 組處理。

圖1 不同處理根際土壤微生物AWCD 值的變化Fig.1 Variation of AWCD of rhizosphere microorganisms under different treatments

AWCD 值變化幅度越大代表微生物的碳源代謝力越強、豐富度越大［19］。對復配拮抗菌FP246在不同接種時間下的AWCD 值進行主成分分析，從31 種因子中提取4 個主成分因子，其中PC1、PC2 主成分得分貢獻率分別為64.98%和30.33%，累計貢獻率為95.31%。對PC1、PC2 主成分的得分進行作圖（圖2）表明，接種72 h 的得分在第3 象限、與其他培養時間點距離較遠，表明碳源在72 h時與其他時間點的利用情況差異顯著。雖然96 h在PC2 軸上的得分略高于120 和144 h，但后者均位于第1 象限，且距離極為接近，同時二者得分在PC2 軸上與其他時間點的距離較遠，說明接種120和144 h 對微生物碳源的利用情況有顯著影響。而接 種168、192、216、240 h 的 得 分相近，說明Biolog-ECO 微平板在接種168 h 及以后，微生物對碳源的利用情況相似，且無明顯差異。主成分分析結果表明，在Biolog-ECO 微平板接種96～144 h時間段內，微生物對碳源的利用較為活躍，并與其他時間段存在顯著差異。

圖2 AWCD 值的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of AWCD

2.3 不同接種時間微生物群落的多樣性分析

圖3 培養時間對根系微生物多樣性指數的影響Fig.3 Effects of incubation time on diversity index of rhizosphere microorganisms

圖3 表明，接種過程中，不同處理的微生物群落多樣性指數發生了變化。在接種72 h 后，T1、T3 處理的Shannon-Wiener 多樣性指數均高于T2、T4 處理，表明經T1、T3 處理后的土壤微生物多樣性高于T2、T4 處理。在不同接種時間，McIntosh指數整體上為T3＞T1＞T2＞T4，且同一時間點不同處理之間存在顯著差異。隨接種時間的增加，McIntosh 指數呈上升趨勢，在168 h 后趨于平穩。在接種96～240 h 期間，T1、T2、T3 處理的Simpson優勢度指數變化不大，而T4 處理先上升后趨于平緩。豐富度指數結果顯示，T1 和T3 處理均與T2、T4 處理存在顯著差異，并且在接種培養168 h 以后，各處理的豐富度指數趨于穩定。

2.4 微生物對不同碳源的利用特征

ECO 微平板含有31 種碳源，分別為胺類（苯乙基胺、腐胺）、糖類（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖內脂、D-木糖、I-赤藻糖醇、D-甘露醇、N-乙?；?D-葡萄胺、D-纖維二糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、α-D-乳糖、D,L-α-甘油）、酚酸類（2-羥苯甲酸、4-羥基苯甲酸）、羧酸類（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羥基丁酸、D-葡萄胺酸、衣康酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸）、氨基酸類（L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸-L-谷氨酸）、聚合物類（吐溫40、吐溫80、α-環糊精、肝糖）［20-21］。通過測定不同碳源的平均吸光值，可以從側面反映微生物對各類碳源的利用情況。由圖4 可知，在接種96～240 h 期間，每個處理對糖類均有較高程度的利用，且均與T4 處理存在顯著差異。各處理在接種120 h 后，微生物對氨基酸的利用趨于穩定，其中T3 處理利用氨基酸的程度略高于T1 和T2 處理。對羧酸類物質的利用程度，T1處理在72～240 h 均高于其他處理，表明T1 處理利用羧酸類物質的能力比T3 處理更強。隨著接種時間的延長，微生物對聚合物類物質的利用整體上呈T2＞T1＞T3＞T4。此外，各處理對胺類和酚酸類物質的利用程度顯著低于上述碳源，但均高于對照處理。綜上，微生物對糖類、氨基酸類、羧酸類以及聚合物類物質的利用程度較高，且對這4類碳源的利用在接種120 h后變化趨于平緩。

圖4 培養時間對微生物碳源利用的影響Fig.4 Effects of incubation time on carbon source utilization of microorganisms

3 討論

Biolog-ECO 技術能快速反映微生物群落的特征變化［22］。土壤微生物群落多樣性指數越高，其多樣性越豐富，則土壤微生態功能越穩定。本研究中，與對照相比，各處理AWCD 值和群落多樣性指數均顯著升高?？赡茉颍孩偻寥乐袪I養物質豐富、適宜微生物的生長；②外源功能菌施入后大量繁殖，微生物種類和數量大幅度增加，對微平板中的碳源利用能力增強，與劉輝等［23］研究結果一致。主成分分析可用點的位置直觀反映土壤微生物群落多樣性的變化，并且樣品的得分與相似度呈反比［24-25］。主成分分析結果顯示，復配拮抗菌PF246 在接種120 h 和144 h 的得分極為相似，且與96 h 的得分接近。結合發病情況進行分析，在接入黑脛病菌96 h 后，黑脛病開始進入盛發期，增加土壤微生物對碳源的利用量，從而增強微生物的活性，豐富微生物群落的多樣性。此外，枯草芽孢桿菌對氨基酸具有一定的趨化性，可以促進其他物質的合成。本研究中，T2 處理對氨基酸及聚合物的利用程度大于T1處理，與其他研究結果相似［26-27］。T1、T2、T3 處理后均能提高黑脛病的防治效果，增加土壤微生物的多樣性，提高碳源的利用程度，可能是因為土壤微生物產生的代謝物質能影響植物根系細胞的通透性，促進植物對水分和營養元素的吸收，并能誘導植物產生抗病性，從而提高植株的抗病性，減輕病害的發生［28］。

農藥的使用會對土壤微生物產生不同程度的影響，即使較低濃度也能引起微生物群落發生明顯變化［29-31］。楊琴［32］發現甲霜錳鋅在一定濃度范圍內對土壤微生物的數量具有激活作用，可增加微生物多樣性指數，與T3 處理后的結果基本一致。農藥處理后微生物多樣性增加，可能是由于農藥對土壤環境結構修飾后，改善了微生物的營養狀況，使土壤有機物質更易被吸收利用，從而使土壤有益微生物的種類和數量得以增加，但具體原因有待進一步研究。

4 結論

①與單一拮抗菌YJC-4 相比，復配拮抗菌FP246 提高了煙草黑脛病的防治效果。②復配拮抗菌FP246 處理后增強了土壤微生物的碳源代謝能力，提升了微生物的豐富度。在接種培養96 h后，微生物對碳源的利用能力明顯升高。③3 個處理的Shannon-Wiener 多樣性指數、McIntosh 指數、Simpson 優勢度指數、豐富度指數均顯著高于對照，表明土壤微生物的種類、數量、群落多樣性增加。④土壤微生物對碳源的利用程度升高，特別是糖類、氨基酸類、羧酸類、聚合物類物質。