多花黃精植株再生及繁殖研究

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(1.福建農林大學園藝學院， 福州 350002;2.蘭科植物保護與利用國家林業與草原局重點實驗室， 福州 350002)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua)屬于百合科( Liliaceae )黃精屬(PolygonatumMill.)多年生草本藥用植物[1-2]。分布在東北、華北、西北和華東等地，多花黃精集藥用、觀賞和食用價值于一體，根莖含淀粉、煙酸、黃酮、多種氨基酸、維生素、多種皂甙，具有益氣養陰、強壯筋骨、治療風濕痛、降血脂、降血壓、降血糖、抗衰老及抗腫瘤等作用[3-7]。隨著多花黃精藥用價值的開發，野生資源被人為肆意挖掘破壞嚴重，使得有限的野生資源逐漸減少[8-9]。

由于多花黃精種子繁殖后代性狀分化嚴重，不能通過播種大量繁殖苗木[10]。繁育培養既能實現植物個體的快速大量繁殖，又能較好地保持植物的種質特性[11]，是實現多花黃精工廠化育苗，加快良種推廣應用的關鍵技術。有關多花黃精的組培快繁技術已有不少研究[12-19]，但主要集中在根莖繁殖[13]，使用未成熟黃精莢果進行芽萌發誘導少見報道。為了建立一套高效、高質、快速的多花黃精工廠化育苗體系，本實驗在前人對多花黃精組培快繁技術研究與生產實踐的基礎上，選取優質多花黃精母株上成熟度為70%的莢果為外植體進行繁育，研究不同激素、不同生長素配比、不同光照強度控制等因素對多花黃精種子芽萌發誘導、芽增殖誘導、瓶苗生根誘導及移栽的影響，建立了多花黃精植株再生體系。

圖1 A為野生多花黃精植株，B為成熟度為70%莢果

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料采自福建泰寧大田鄉壘際村夏家地海拔500 m的林下，選擇長勢良好黃精植株作為母株，取顆粒飽滿、無病蟲害、成熟度為70%的莢果，用濕紗布包裹帶回實驗室，置4 ℃冰箱中保存備用。

1.2 外植體處理

用洗衣粉清洗去除莢果表面塵埃，置于流水下沖洗干凈，純水沖蕩2～3遍，置于超凈工作臺內用體積分數為75%酒精消毒30 s，用5%次氯酸鈉消毒10～15 min并加入2～3滴吐溫80，無菌水沖蕩3～4遍后，用無菌濾紙吸干材料表面水分備用。

1.3 培養基與培養條件

基本培養基為MS，附加蔗糖 20 g·L-1、瓊脂 7.0 g·L-1、活性炭 0.5 g·L-1，pH值為5.8，溫度為(23±2)℃，初始接種的培養體在暗培養條件下5～10 d，然后移到光照強度為0～2 000 lx 遞增培養，光照時間為每天10 h。

1.4 外植體選擇

將無菌處理后的莢果，用無菌手術刀剝除外種皮，把剝除種皮后的種子接種到MS培養基上，附加蔗糖20 g·L-1、瓊脂7.0 g·L-1、活性炭0.5 g·L-1，pH值為5.8，總計5個組，每組接10瓶，每瓶接入3粒種子，重復3次。在溫度(23±2)℃下暗培養10 d。10 d后移到光照強度為0～2 000 lx下培養，光照時間為每天10 h。30 d后統計萌發率，用于研究不同成熟度對種子萌發的影響。

萌發率(%)=(每組萌發種子粒數/每組接種種子粒數)×100%。

1.5 誘導種子萌發

將無菌處理后的種子，用無菌手術刀剝除外種皮，把剝除種皮后的種子接種到MS基本培養基，附加蔗糖 20 g·L-1、瓊脂 7.0 g·L-1、活性炭 0.5 g·L-1，pH值為5.8，然后將不同質量濃度的BA、NAA分組加入，總計15個組，每組接10瓶，每瓶接入3粒種子，重復3次。在溫度(23±2)℃下暗培養10 d。10 d后移到光照強度為0～500 lx遞增培養，光照時間為每天10 h。30 d后統計萌發率，研究不同質量濃度BA、NAA配比對多花黃精種子芽誘導萌發的影響。

誘導萌發率(%)=(萌發粒數/接種總粒數)×100%。

1.6 誘導芽增殖

當種子抽出莖葉并長出胚根時，切取莖段，將其轉入MS基本培養基中進行增殖培養，附加蔗糖 20 g·L-1、瓊脂 7.0 g·L-1、活性炭 0.5 g·L-1，pH值為5.8，然后將不同質量濃度的BA、KT、NAA分組加入(見表2)，總計9組，每組接10瓶，重復3次，每瓶接入3個莖段。在溫度(23±2)℃，光照強度從500～1 000 lx遞增，光照時間為每天10 h。培養30 d(見圖3)后統計各處理的誘導芽數和增殖率，從中篩選出最適宜多花黃精誘導芽增殖的培養基。

芽增殖率(%)=(每組增殖粒數/每組接種粒數)×100%。

1.7 誘導瓶苗生根

經誘導芽增殖培養后，選取長勢健壯的植株，接種到1/2 MS基本培養基進行生根培養(見圖4)，附加蔗糖 20 g·L-1、瓊脂 7.0 g·L-1、活性炭 0.5 g·L-1，pH值為5.8，然后將不同質量濃度的IBA和IAA分組加入(見表3)，總計16組，每組接10瓶，重復3次，每瓶接入1棵植株，溫度(23±2)℃，光照強度從1 000～2 000 lx遞增，光照時間為每天10 h。培養40 d(見圖3)后統計生根率和平均生根數，從中篩選出最適宜多花黃精誘導瓶苗生根的培養基。

圖3 A為接種30 d，B為接種40 d

圖2 去除莢果種皮接種于MS培養基

生根率(%)=(生根苗數/接種苗數)×100%;

平均生根數=每組根數總和/每組接種苗數。

1.8 煉苗與移栽

經生根培養后，選取健壯植株試管苗，置自然光溫室環境下煉苗5～8 d,打開瓶蓋煉苗3～5 d，將根表面殘留培養基沖洗干凈，移栽到V(腐殖質)∶V(粉碎落葉)=2∶1、V(腐殖質)∶V(沙子)=1∶1及V(泥炭土)∶V(腐殖質)∶V(珍珠巖)=6∶3∶1的3種混合基質中，每盆種植1株在溫室環境下培養，移栽苗第1次水澆透，每隔3 d澆水1次(可根據不同季節、天氣來調整)，光照強度保持在1 000～2 000 lx，溫室內空氣濕度保持在75%～85%之間，避免陽光直射。30 d后統計成活率，篩選出最適宜多花黃精瓶苗移栽的基質。

成活率(%)=(成活總數/移栽總數)×100%。

1.9 數據分析

采用DPS分析軟件進行數據處理及方差分析，多重比較采用顯著系數為0.05的Duncan新復極差法分析評價差異顯著性。所有處理應用正交試驗設計法，計算結果用“平均數±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同成熟度莢果對種子萌發的影響

由表1可知，不同成熟度莢果對種子萌發具有不同的影響；30 d后統計發現，萌發率最高。

表1 不同成熟度莢果對種子萌發的影響

處理成熟度/%萌發率/%H120 1.67±0.57eH25029.67±0.58bH37052.00±1.00aH49024.33±0.58cH5100 9.00±0.82d

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著水平。下同。

2.2 不同濃度NAA、BA對芽誘導的影響

以MS為基本培養基，將不同濃度的NAA、BA分組加入，在溫度(23±2)℃下暗培養10 d。10 d后移到光照強度為0～500 lx條件下培養，光照時間為每天10 h。30 d后統計萌發率，由表2可知：在不加NAA的W 2到W 5中，隨著BA濃度的遞增，芽誘導萌發率呈先增后減的趨勢；當BA濃度為0.5 mg·L-1時，萌發率最高，為61.33%，效果最明顯；隨著BA濃度從0.5 mg·L-1到1.5 mg·L-1增加，萌發率呈遞減趨勢；當BA濃度為1.5 mg·L-1時，抽出的芽有死亡的預兆。在不加BA的W 6和W 11中，隨著NAA濃度的增加，誘導萌發率較低，與空白對照的W 1無顯著性差異；在W 7到W 10中，當NAA濃度為0.1 mg·L-1時，隨著BA濃度的增加，誘導萌發率呈遞減趨勢，BA濃度為0.5 mg·L-1時，效果最明顯；W 12到W 15呈現出與W 6到W 11一致的現象。在W 2、W 7、W 12中，BA濃度為0.5 mg·L-1不變，隨著NAA濃度從0 mg·L-1到0.3 mg·L-1遞增，誘導萌發率呈遞減趨勢，且BA濃度為0.5 mg·L-1、NAA濃度為0 mg·L-1時，效果最明顯。綜上：多花黃精種子芽誘導培養最適宜的培養基為MS+BA 0.5 mg·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖 20 g·L-1+活性炭 0.5 g·L-1。

圖4 A為增殖誘導，B為移栽

表2 不同質量濃度NAA、BA對芽誘導的影響

處理NAA/(mg·L-1)BA/(mg·L-1)誘導萌發率/%W10.00.0 8.04±0.78eW20.00.5 61.33±2.52aW30.01.0 42.24±2.05cW40.01.5 42.31±2.08cW50.02.0 25.33±2.07dW60.1 0.0 8.09±0.53eW70.1 0.5 52.81±2.04bW80.1 1.0 42.23±2.11cW90.1 1.5 42.30±2.12cW100.1 2.0 25.28±2.01dW110.3 0.0 8.12±0.48eW120.3 0.5 52.79±1.98bW130.3 1.0 42.29±2.11cW140.3 1.5 25.26±1.91dW150.3 2.0 8.08±0.62e

2.3 不同濃度激素配比對誘導芽增殖的影響

由表3可知，不同濃度激素配比對多花黃精誘導芽增殖具有不同的影響；經增殖培養，30 d后統計發現，在M 1、M 4、M 7中，KT為0.5 mg·L-1，隨著BA濃度的遞增，誘導芽數和增殖率都呈遞增趨勢，當BA濃度為1.5 mg·L-1，叢生芽較多，有效芽少，可知高濃度BA有利于增殖倍數的增加，抑制有效芽產生；在M 4到M 6中，BA為1.0 mg·L-1，隨著KT濃度的遞增，NAA濃度的遞減，誘導芽數和增殖率M 5>M 6>M 4，表明在KT濃度為1.0 mg·L-1時，出芽情況最佳；在M 2、M 4、M 7、M 8處理中，誘導芽數和增殖率沒有顯著性差異，但NAA濃度為0.5 mg·L-1的M 2和M 4較NAA濃度為0.3 mg·L-1和 0.1 mg·L-1的M 7和M 8長勢差，M 7和M 8中芽苗長勢好，葉色綠；NAA為0.3 mg·L-1時，接種的材料有毛細根生成，且生長較快。芽苗長勢最好且有效芽最多的是處理M 5，效果最明顯；綜上：多花黃精誘導芽增殖培養的適宜培養基為MS + NAA 0.3 mg·L-1+ BA 1.0 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1+ 蔗糖 20 g·L-1+ 瓊脂 7.0 g·L-1+ 活性炭 0.5 g·L-1，誘導芽數為3.42個，芽增殖率為76.74%，且長勢好，生根快。

2.4 不同濃度激素配比對誘導生根的影響

由表4可知，不同濃度激素配比對誘導生根具有不同的影響，經生根培養，40 d后統計發現，在只加入IAA的P 2到P 4中，隨著IAA濃度遞增，生根率和平均生根數呈遞增趨勢；在只加入IBA的P 5到P 7中，隨著IBA濃度的遞增，生根率和平均生根數呈遞增趨勢；從表4可看出，在相同濃度下，只加入IBA培養基各方面指標明顯優于只加入IAA的培養基；故生根培養誘導能力IBA>IAA。在加入不同濃度、不同配比的P 8到P 10中，IAA為0.5 mg·L-1，IBA從0.5 mg·L-1到1.5 mg·L-1遞增，生根率和平均生根數呈遞減趨勢；P 11到P 13和P 14到P 16與P 8到P 10結果一致；即IBA為0.5 mg·L-1最有利于瓶苗生根。在加入IBA 0.5 mg·L-1和IAA 1.0 mg·L-1的P 11中，生根率為81.71%，平均生根數為6.11個，效果最明顯；綜上：多花黃精瓶苗生根培養適宜培養基為1/2 MS+IAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1。

2.5 移栽基質的選擇

經移栽培養，30 d后統計發現，在V(腐殖質)∶V(落葉)=2∶1、V(腐殖質)∶V(沙子)=1∶1及V(泥炭土)∶V(腐殖質)∶V(珍珠巖)=6∶3∶1三種混合基質中都能成活，移栽成活率分別為72%、65%、85%，因此移栽的適宜基質為V(泥炭土)∶V(腐殖質)∶V(珍珠巖)=6∶3∶1的混合基質。

表3 不同濃度激素配比對誘導芽增殖的影響

處理BA/(mg·L-1)KT/(mg·L-1)NAA/(mg·L-1)誘導芽數增殖率/%長勢M10.50.50.11.24±0.05d41.37±1.38e﹣M20.510.52.29±0.12c58.07±2.02c﹢M30.51.50.33.28±0.07b62.44±2.12b﹢﹢M410.50.52.27±0.06c58.12±1.92c﹢M5110.33.42±0.09a76.74±2.35a﹢﹢﹢M611.50.13.26±0.05b62.47±2.07b﹢﹢M71.50.50.32.31±0.14c62.41±2.08b﹢﹢M81.510.12.29±0.08c62.39±2.14b﹢﹢M91.51.50.51.27±0.04d43.36±1.34d﹣

注：“﹢﹢﹢”表示長勢好，“﹢﹢”表示長勢較好，“﹢”表示長勢一般，“﹣”表示長勢差。下同。

表4 不同濃度的激素配比對誘導生根的影響

處理IAA/(mg·L-1)IBA/(mg·L-1)生根率/%平均生根數長勢P10012.01±0.32g1.70±0.10f﹣P20.5024.93±0.91f2.96±0.15e﹢P31024.97±0.82f3.09±0.11e﹢P41.5026.82±1.21e3.11±0.09e﹢P500.526.78±1.18e3.13±0.05e﹢P60136.27±1.47d4.17±0.12d﹢P701.536.33±1.52d4.18±0.08d﹢P80.50.570.66±2.08b5.14±0.15b﹢﹢P90.5158.23±1.98c4.72±0.09c﹢﹢P100.51.558.27±2.02c4.82±0.12c﹢﹢P1110.582.71±2.52a6.11±0.08a﹢﹢﹢P121170.64±2.09b5.14±0.13b﹢﹢P1311.558.31±2.09c4.84±0.06c﹢﹢P141.50.570.68±2.02b5.15±0.11b﹢﹢P151.5170.62±1.94b5.12±0.14b﹢﹢P161.51.536.32±1.42d4.16±0.09d﹢﹢

3 討 論

3.1 外植體的選擇

本研究以成熟度為70%的野生多花黃精母株上的莢果為外植體，在繁育過程中發現，取完全成熟的果子比70%成熟度莢果為外植體的萌發時間要遲30～35 d，成熟度為20%～50%的種子萌發時間較成熟度70%種子萌發率低，萌發生長不一致甚至出現死亡發黑現象。內源激素ABA會抑制胚的萌發，誘導種子休眠；而多花黃精種子在成熟過程中，前期ABA含量較高，中期ABA含量最低，完熟期ABA變高[20]。這與本研究結果一致，因此，選擇莢果成熟度為70%的野生多花黃精為外植體，更有利于解除種子休眠，促進離體培養時種子的萌發。

3.2 芽誘導培養中存在的問題

在芽誘導培養中，在W 2到W 5中，隨著BA濃度遞增，種子萌發率呈先增后減的趨勢；當BA濃度為0.5 mg·L-1時，萌發率最高，為61.33%；隨著BA濃度(0.5～1.5 mg·L-1)的增加，萌發率呈降低趨勢；當BA濃度為1.5 mg·L-1時，抽出的芽有死亡的預兆；在W 2、W 7、W 12中，BA濃度為0.5 mg·L-1不變，隨著NAA濃度從0～0.3 mg·L-1遞增，誘導萌發率呈遞減趨勢，表明NAA在多花黃精芽誘導培養中沒有明顯作用。由于黃精種子在打破休眠，生長期長、難以取材等方面有一定的難度，所以有關使用未成熟黃精莢果進行芽萌發誘導的研究少有報道。在繁育培養中，多花黃精種子易于消毒，較根莖容易建立無菌體系[21]。本研究61.33%的芽誘導率不太理想，希望能為多花黃精種子芽誘導萌發培養提供材料。

3.3 芽增殖培養中存在的問題

在誘導芽增殖培養中，若要提高增殖倍數需增加BA和KT的用量，但得到的芽苗細弱，相反若想讓芽苗長得完整、健壯，則增殖倍數就會降低[22]，這與本研究結果一致，當BA濃度為1.5 mg·L-1時，增殖倍數增加，有效芽少；因此，在既保證有效健壯芽的增加又能提高增殖倍數的情況下，選擇出多花黃精種子誘導芽增殖最適宜的培養基是MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1；誘導芽數為3.42個，芽增殖率為76.74%。

表5 不同基質配方對瓶苗移栽成活的影響

處理基質成活率/%V1V(泥炭土)∶V(腐殖質)∶V(珍珠巖)=6∶3∶185V2V(腐殖質)∶V(沙子)=1∶165V3V(腐殖質)∶V(粉碎落葉)=2∶172

3.4 生根培養中存在的問題

本研究結果表明：生根培養時以1/2 MS為基本培養基，加入IBA 0.5 mg·L-1和IAA 1.0 mg·L-1后，效果最佳，生根率為81.71%，這與劉紅美等[23]的研究結果不同，這可能與試驗中使用的藥品來源、碳源種類、光照時間、光照強度、培養時間或黃精的種源等不同有關；本研究還得出不同質量濃度的生長素對生根培養的誘導能力IBA>IAA，這與周新華等[24]的研究結論相同。然而，由于試驗規模和時間的限制，加之生根培養受多種因素的影響[25]，本研究僅從IBA和IAA的不同配比、溫度、光照時間及光照強度等幾方面入手探討其對黃精誘導生根的影響；未能從不同添加劑、不同激素種類及其濃度與配比、不同基本培養基等對誘導生根的影響問題進行探討，有不足之處還需要作進一步的試驗研究。

3.5 不同光照強度對多花黃精種子離體培養的影響

通過觀察，誘導芽增殖培養時，將瓶苗從500 lx移到1 000 lx下，培養幾天后，發現在突然增加光照強度時，瓶苗出現黃化，長勢不良的狀況；誘導生根時，從1 000 lx移到2 000 lx則不會出現這樣的現象；綜上，多花黃精種子誘導芽增殖培養時對光照強度較敏感，需要一定的適應階段，在繁育過程中可根據不同的生長階段供給不同區間的光照強度，光照強度從0～2 000 lx遞增培養，光照時間為每天10 h，幫助植物盡快適應外部環境；多花黃精誘導生根培養時對光照強度適應性強，這與周新華等[24]的研究結論相同。

4 結 論

本試驗以成熟度為70%的優質多花黃精種子為外植體，進行了種子萌發、芽增殖、瓶苗生根和移栽的研究，建立多花黃精植株再生體系。芽誘導適宜培養基為MS+BA 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1瓊脂7.0 g·L-1+蔗糖20 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1；芽增殖適宜培養基為MS+BA 1.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1；生根適宜培養基為1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 1.0 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+瓊脂7.0 g·L-1+活性炭0.5 g·L-1；瓶苗移栽適宜基質為V(泥炭土)∶V(腐殖質)∶V(珍珠巖)=6∶3∶1的混合基質。

試驗結果表明：采用成熟度為70%的優質多花黃精莢果為外植體，進行繁育培養。通過該技術建立的再生體系可獲得61.33%以上的正常萌芽；芽增殖培養時，誘導芽數為3.42個，芽增殖率為76.74%；經瓶苗生根培養，生根率為81.71%，平均生根數為6.11個；經煉苗移栽，成活率達85%。