miR-138調(diào)節(jié)SIRT1p-STAT3通路抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化

丁國(guó)明 鄭壽浩 戢 晴 阮 園

糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥，屬于糖尿病慢性并發(fā)癥中的微血管病，其機(jī)制與細(xì)胞外基質(zhì)沉積過(guò)多、腎小球系膜細(xì)胞肥大、基膜增厚、腎小球與腎間質(zhì)發(fā)生纖維化改變有關(guān)。微小RNA(microRNA，miRNA)是長(zhǎng)約22nt的非編碼RNA，能夠與mRNA結(jié)合阻斷蛋白編碼基因的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[1～3]。miR-138能促進(jìn)過(guò)氧化物酶受體的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)脂肪細(xì)胞分化[4]。同時(shí)miR-138可促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(TGF-β)受體和及Ⅳ型膠原的表達(dá),加重腎臟纖維化程度，激活單核細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)，增加細(xì)胞因子釋放，介導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂，暴露膠原組織，加速血小板附著和聚集，加劇腎臟損傷程度[5，6]。

SIRT1是Ⅲ類(lèi)去乙酰化酶組蛋白的成員，通過(guò)去乙酰化和微調(diào)蛋白質(zhì)因子(包括內(nèi)皮型一氧化氮合成酶)的活性，參與衰老、代謝和對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性[7]。SIRT1通過(guò)抑制血管生成和減少動(dòng)脈內(nèi)壁脂質(zhì)沉淀，成為血腎小球血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[8]。P-STAT3是SIRT1 mRNA靶向非翻譯區(qū)(UTR)的結(jié)合分子，具有促進(jìn)炎性、纖維化因子結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)高表達(dá)的作用[9,10]。目前關(guān)于糖尿病腎病與miR-138、SIRT1p-STAT3調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少。本研究擬探討miR-138調(diào)節(jié)SIRT1p-STAT3通路抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化，為糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

資料與方法

1.細(xì)胞來(lái)源、儀器與試劑:大鼠腎小球系膜細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù))、DnJ-4249CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Revco公司)、RPMI1640 培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)、胰酶(德國(guó)Merck公司)、四甲基偶氮唑藍(lán)(北京廣源恒信科技發(fā)展有限公司)、99.99%葡萄糖(美國(guó)Thermo公司)、Lipofectamine2000 脂質(zhì)體(美國(guó)Invitrogen公司)、miRNA-138-mimics、序列：5′-CCAGUCAGUUCCUGAUGCAGUA-3′、NG+miRNA-138(沉默)-mimics序列：5′-GAUGUCAGUUCCAUCGUUGCUCAG-3′(上海伯豪生物技術(shù)有限公司)、吖啶橙(中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品)、胎牛血清(美國(guó)康寧公司)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen Thermo Fisher Scientifc公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(英國(guó)Cambridge公司)、FCRL5基因的表達(dá)測(cè)定采用UltraSYBR One Step RNA PCR Kit(寶生物工程大連有限公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)熱電公司)、NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)、SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN蛋白 Elisa 試劑盒(德國(guó)Merck公司)、DMI3000 B倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、MK3酶標(biāo)儀(美國(guó) Thermo公司)、恒溫培養(yǎng)箱grp-9080(美國(guó)通用公司)二氧化碳培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)、超凈工作臺(tái)(上海恒躍醫(yī)療器械有限公司)。

2.細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)、分組設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染情況檢測(cè)

(1)細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)：將裝有大鼠腎小球系膜細(xì)胞株的凍存管從液氮中取出，37℃水浴箱迅速解凍，吸取菌液至5ml EPP無(wú)菌管中，1500r/min，離心5min，上清液吸棄，加入pH值為7.2含10%胎牛血清、鏈霉素100μg/ml、青霉素100μg/ml、的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，3天換液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，用0.5%胰蛋白酶消化傳代。

(2)分組設(shè)計(jì):正常濃度葡萄糖組(4.0mmol/L，normal glucose，NG)、 高濃度葡萄糖組(40.0mmol/L，high glucose,HG)：取5ml大鼠腎小球系膜細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml 8.0mmol/L、80.0mmol/L的無(wú)菌葡萄糖溶液，置于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2、20%O2)。NG+miRNA-138沉默組、NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組：取5ml大鼠腎小球系膜細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml轉(zhuǎn)染miRNA-138-mimics、NG+miRNA-138(沉默)-mimics以及10ml 8.0mmol/L的無(wú)菌葡萄糖溶液，轉(zhuǎn)染按照美國(guó)Invitrogen公司 Lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。HG+miRNA-138沉默組、HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組：取5ml大鼠腎小球系膜細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)于10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，分別加入5ml轉(zhuǎn)染miRNA-138-mimics、NG+miRNA-138(沉默)-mimics以及10ml 80.0mmol/L的無(wú)菌葡萄糖溶液，轉(zhuǎn)染按照美國(guó)Invitrogen公司 Lipofectamine2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(3)轉(zhuǎn)染情況檢測(cè):即用型免疫組化法進(jìn)行轉(zhuǎn)染情況檢測(cè)，miRNA-138-mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞核內(nèi)有明顯的棕黃色顆粒, 而miRNA-138沉默細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染成藍(lán)色。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72h。

3.各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞株miRNA138 RNA水平的檢測(cè):取5ml細(xì)胞液(細(xì)胞濃度為5×106/ml)，5000r/min離心5min，miRNeasy Mini試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)提取總RNA，NanoDrop1000(美國(guó)NanoDrop公司)定量RNA純度。TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)進(jìn)行RT反應(yīng)。為合成cDNA，將反應(yīng)混合物依次在16℃下孵育30min，在42℃下孵育30min，在85℃下孵育5min。參照GenBank 數(shù)據(jù)獲取 2 個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)待測(cè)基因位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物(參照http：//links.lww.com/MD/A675)，按20μl模板和10μl 反應(yīng)液構(gòu)成 PCR反應(yīng)體系， 擴(kuò)增程序: 95℃ 5min; 93℃10s，61℃ 30s，重復(fù) 40個(gè)循環(huán)，61℃時(shí)采集熒光(表1、表2)。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀檢測(cè)其表達(dá)量。

表1 miRNA-138、β-actin RNA引物序列

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

4.各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞株SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF蛋白水平測(cè)定:染毒結(jié)束后，5000r/min離心收集各組細(xì)胞，加入PBS制成細(xì)胞懸液后，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定培養(yǎng)液中SIRT1、P-STAT3、CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF蛋白水平。

結(jié) 果

1.各組細(xì)胞miRNA-138 RNA、SIRT1、P-STAT3水平比較:由表3可見(jiàn)，HG組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG組，SIRT1水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138沉默組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平低于NG組，SIRT1水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG組，SIRT1水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于NG+miRNA-138沉默組，SIRT1水平低于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平低于HG組，SIRT1水平高于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于HG組，SIRT1水平低于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組miRNA-138 RNA、P-STAT3水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表3 各組細(xì)胞miRNA-138 RNA、SIRT1、P-STAT3水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

2.各組細(xì)胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平比較：由表4可見(jiàn)，HG組TGF-β1、VEGF水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF水平低于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表4 各組細(xì)胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

3.各組細(xì)胞纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平比較:由表5可見(jiàn)，HG組CTGF、ET-1、FN水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組CTGF、ET-1、FN水平低于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于NG組(P<0.05)；NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于NG+miRNA-138沉默組(P<0.05)；HG+miRNA-138沉默組CTGF、ET-1、FN水平低于HG組(P<0.05); HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于HG組(P<0.05)；HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組CTGF、ET-1、FN水平高于HG+miRNA-138沉默組(P<0.05)。

表5 各組細(xì)胞纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平比較

與NG組比較,*P<0.05；與NG+miRNA-138沉默組比較,#P<0.05；與HG組比較,ΔP<0.05；與HG+miRNA-138沉默組比較,▲P<0.05

4.SIRT1p-P-STAT3通路各指標(biāo)相關(guān)性分析:由表6可見(jiàn)，miRNA-138與SIRT1呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，SIRT1與P-STAT3呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，P-STAT3與CTGF、ET-1、FN、TGF-β1、VEGF呈正相關(guān)(P<0.05)。

表6 SIRT1p-P-STAT3通路各指標(biāo)相關(guān)性分析

討 論

大量證據(jù)表明microRNAs的失調(diào)與細(xì)胞炎癥、纖維化反應(yīng)有關(guān)[11]。miR-138通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑PI3K/AKT抑制肌纖維細(xì)胞炎癥。miR-143充當(dāng)平滑肌細(xì)胞和HUVEC之間的通信分子，抑制HUVEC纖維化反應(yīng)[12]。miR-155通過(guò)抑制細(xì)胞特異性靶基因在內(nèi)皮炎癥、纖維化反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮調(diào)節(jié)生成作用。

研究表明，miR-138是腎小球系膜細(xì)胞的損害因子。最近的一項(xiàng)研究表明，高糖水平誘導(dǎo)的miR-138過(guò)表達(dá)是腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)因子SIRT1的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其通過(guò)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)減少一氧化氮的產(chǎn)生[13,14]。本研究結(jié)果顯示，HG、NG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于NG組；NG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平低于NG組； NG+miRNA-138、HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于NG+miRNA-138沉默組；HG+miRNA-138沉默組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平低于HG組; HG+miRNA-138轉(zhuǎn)染組TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN水平高于HG組；說(shuō)明高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞miR-138的表達(dá)增加，能明顯增強(qiáng)炎癥、纖維化反應(yīng)，進(jìn)一步就miR-138致炎癥、纖維化機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，miR-138負(fù)向調(diào)控SIRT1，SIRT1是腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)因子，其能抑制腎小球系膜細(xì)胞損害過(guò)程中伴隨的炎癥、纖維化反應(yīng)。

國(guó)外研究表明，SIRT1能下調(diào)促炎細(xì)胞因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和IL-1b、ET-1、FN[15]。通過(guò)抑制SIRT1的表達(dá)，雷帕霉素靶蛋白(mTOR)已顯示出促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞炎癥、纖維化反應(yīng)的能力[16]。結(jié)合本研究結(jié)果中，SIRT1與TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN呈負(fù)相關(guān)，筆者推測(cè)高糖水平破環(huán)SIRT1的正常表達(dá)而促進(jìn)TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN過(guò)表達(dá)，進(jìn)而加劇腎小球系膜細(xì)胞炎癥、纖維化反應(yīng)。P-STAT3是炎癥、纖維化反應(yīng)的響應(yīng)細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，STAT3被受體磷酸化，形成同源二聚體或異源二聚體，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，發(fā)揮調(diào)控作用，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的體外增殖實(shí)驗(yàn)中，SIRT1磷酸化p-STAT3促進(jìn)VEGF、IL-6、FN的分泌[17，18]。此外，SIRT1也抑制了HepG2細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)。在本研究中，SIRT1與P-STAT3呈負(fù)相關(guān)，SIRT1對(duì)p-STAT3蛋白的表達(dá)具有抑制作用 ，與上述結(jié)果一致，提示SIRT1可能通過(guò)抑制p-STAT3蛋白表達(dá)而起到高糖促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化。

本研究結(jié)果表明，miR-138在介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化過(guò)程中起重要作用。 研究發(fā)現(xiàn)miR-138通過(guò)調(diào)控細(xì)胞炎性因子TGF-β1、VEGF水平以及纖維化因子CTGF、ET-1、FN水平參與高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞損害。作為miR-138的直接靶分子，SIRT1過(guò)表達(dá)能起到保護(hù)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制腎臟纖維化的作用，由SIRT1介導(dǎo)的pSTAT3蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)也是高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞損害的原因。 因此，本研究初步表明高糖能誘導(dǎo)miR-138水平過(guò)表達(dá)，抑制SIRT1表達(dá)，進(jìn)而p-STAT3、TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN高水平表達(dá)，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化。

綜上所述，miR-138促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎性反應(yīng)及纖維化，其機(jī)制與抑制SIRT1引起的P-STAT3的磷酸化、導(dǎo)致TGF-β1、VEGF、CTGF、ET-1、FN高表達(dá)有關(guān)。