miR-9-5p下調(diào)FRMD6促喉癌Hep2細(xì)胞存活的機制研究

程秀琴 譚元元 艾力根·阿不都熱依木 唐 亮

喉癌作為頭頸部最常見的呼吸道腫瘤之一，發(fā)生率位居第二，且以鱗狀細(xì)胞癌最為多見。有研究顯示，喉癌的發(fā)生率逐年攀升，每年約增長25%[1～3]。雖然近年來更先進(jìn)的外科手術(shù)、化療藥物及放射療法已廣泛應(yīng)用于喉癌的臨床治療，然而喉癌患者的總生存率并未得到改善，甚至有所下降[4]。研究發(fā)現(xiàn)，喉癌的發(fā)生、發(fā)展與Ras、c-myc、EFGR等致癌基因和 p53、Rb、p16等抑癌基因密切相關(guān)，但喉癌分子水平的發(fā)病機制仍不明確[5，6]。

miRNA是一類高度保守的長度約為22nt非編碼RNA分子，被認(rèn)為是一類新型的癌基因或者抑癌基因。miRNA芯片研究表明多種miRNA是喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)預(yù)后及診斷的獨立影響因子，在LSCC發(fā)生、發(fā)展中起著促癌基因或者抑癌基因作用[7，8]。隨著研究的不斷深入，miR-9-5p在癌癥中的作用逐漸見諸報道，如在宮頸癌和肺癌中，它被認(rèn)為是致癌分子，但在胃癌、結(jié)腸癌等中有報道稱它是一種抑癌劑[9～12]。但對于miR-9-5p及其在喉癌中的具體作用機制尚不清楚。FRMD 6是一種Ezrin/Radisin/Moesin(ERM)家族蛋白，是果蠅的人類同源性擴展(EX)基因，其控制細(xì)胞增殖、凋亡、組織再生和腫瘤發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)FRMD 6可作為人乳腺癌細(xì)胞的腫瘤抑制劑，F(xiàn)RMD 6基因敲除能誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，即促進(jìn)腫瘤細(xì)胞獲得侵襲遷移的能力[13]。另有研究表明，F(xiàn)RMD6依賴或獨立于Hippo信號通路發(fā)揮作用[14]。但目前在喉癌中未有FRMD6相關(guān)報道。

本團隊在前期研究中通過實時定量PCR對喉癌中的miRNA差異表達(dá)進(jìn)行初步篩選，并初步明確了miR-9-5p對喉癌Hep2細(xì)胞增殖的影響。為進(jìn)一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，筆者從miR-9-5p調(diào)控FRMD 6的表達(dá)進(jìn)而影響喉癌Hep2細(xì)胞的存活來探討分子水平的發(fā)病機制。

材料與方法

1.材料：(1)DMEM培養(yǎng)基、Opti-MEM、胎牛血清均購自美國Gibco公司; Trizol Reagent和Lipofectamine2000 Transfection Kit均購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司; MTT購自Amresco公司;鼠抗人FRMD 6、YAP、β-actin單克隆抗體均購自美國Cell signaling technology公司; pcDNA3.1-luci載體和Dual-Luciferase?Reporter Assay System均購自美國Promega公司; hsa-miR-9-5p陰性和抑制劑送至吉瑪公司進(jìn)行合成。(2)人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。收集筆者醫(yī)院2010年1月～2017年8月32例原發(fā)性喉癌組織標(biāo)本，患者年齡為43～75歲，所有患者術(shù)前均未接受放、化療處理，均經(jīng)病理證實為喉鱗狀細(xì)胞癌，取癌和癌旁<1cm組織,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染：人喉癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)進(jìn)行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的Hep2細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔2ml培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1h更換為無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基。將 7.5μl的Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入125μl的Opti-MEM 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5min。將各組對照抑制劑、miR-9-5p抑制劑、陰性對照及miR-9-5p陰性等按終濃度為100pmol加入125μl的Opti-MEM培養(yǎng)基中，混勻后室溫孵育5min。將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和miR-9-5p陰性抑制劑稀釋液充分混勻，室溫孵育20min。將miR-9-5p-Lipofectamine 2000 復(fù)合物滴加6孔板中，每孔250μl，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 4h后更換為有血清有抗生素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

3. MTT法及細(xì)胞克隆形成檢測細(xì)胞增殖：(1)MTT法：實驗分組對照抑制劑、miR-9-5p抑制劑、FRMD6、miR-9-5p 抑制劑+FRMD6，將各組轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞48h后分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞密度為1×104。每組3份，每份1個板，設(shè)3個副孔。每組培養(yǎng)1、2、3、4、5天，孵育4h，取上清，添加150ml DMSO(美國Gibco公司)，通過酶標(biāo)儀檢測各孔570nm波長的吸光度值(A)。計算細(xì)胞相對增殖率(P%)：A(實驗組)/A(空白對照組)×100%，同時繪制細(xì)胞生長曲線，實驗重復(fù)3次。(2)克隆形成實驗：實驗分組對照抑制劑、miR-9-5p抑制劑、FRMD6、miR-9-5p抑制劑+FRMD6，將各組轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞48h后經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液接種于平板中，在每60mm培養(yǎng)皿中植入1000個細(xì)胞，每隔3天更換培養(yǎng)基。7天后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞集落形成情況并進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計。

4.實時熒光定量PCR實驗：Hep2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染對照抑制劑、miR-9-5p抑制劑、陰性對照、miR-9-5p陰性48h后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，分別提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA，PCR引物序詳見表1。每個樣本3個復(fù)孔，按兩步法PCR擴增，條件為：Step 1:95℃ 30s；Step 2:95℃ 5s，60℃ 30s(40個循環(huán))；Step 3: Melt Curve(美國Bio-Rad公司CFX96)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)RT-PCR的擴增曲線及溶解曲線是否滿足要求，儀器軟件中自動輸出Ct值，計算相對表達(dá)量采用2-△△Ct方法。

表1 RT-PCR引物序列

5.Western blot法檢測FRMD6蛋白水平的表達(dá)：Hep2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染陰性對照、miR-9-5p 陰性48h后，收集各組細(xì)胞，分別提取總蛋白并測定蛋白濃度，處理好待測樣品后取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h，經(jīng)FRMD6一抗孵育后，4℃過夜。TBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1h，TBST清洗后顯色液顯色照相。

6.構(gòu)建FRMD6基因3′-UTR熒光素酶報告基因重組載體：以FRMD6 wt 3′-UTR設(shè)計引物，引入XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切位點。引物序列上游5′-CCCTCGAGCAGAGAGATGATTGCTCTGTAT-3′，下游：5′-GCTCTAGACATCTGTTACTTGGATGTGGA-3′。從正常喉組織中提取模板，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，并以其為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95℃/3min；95℃/10s，60℃/2min，30個循環(huán)；72℃/10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1-luci載體經(jīng)雙酶切純化回收后連接過夜，經(jīng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化獲陽性克隆送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。測序鑒定正確的重組子命名為pcDNA3.1-luci/FRMD6。再在重組子基礎(chǔ)上設(shè)計突變引物進(jìn)行PCR獲得FRMD6 mut 3′-UTR重組子：上游序列5′-GGACCAATACGTATGTGACAGA-3′，下游5′-CTTGCTACAACCTTATGATT-3′，使用TaKaRa突變試劑盒進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得克隆，測序鑒定突變正確的重組子命名為pcDNA3.1-luci/FRMD6-mut。

7.雙熒光素酶報告基因檢測：取對數(shù)生長期293T細(xì)胞以1×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔2ml培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將陰性對照、 miR-9-5p陰性分別與FRMD6 wt/mut 3′-UTR熒光素酶報告基因重組載體共轉(zhuǎn)染293T。將 0.1μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑加入125μl的Opti-MEM 培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5min。各組轉(zhuǎn)染用量為：pcDNA3.1-luci/FRMD6 wt或mut 3′-UTR 50ng， 陰性對照或miR-9-5p陰性10pmol，以及海腎熒光Renilla 5ng分別加入到125μl Opti-MEM培養(yǎng)基中共轉(zhuǎn)染，混勻后室溫孵育5min。將Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑稀釋液和各轉(zhuǎn)染組稀釋液充分混勻，室溫孵育20min，將復(fù)合物滴加6孔板中于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后收取細(xì)胞，用Promega公司的雙熒光素酶報告基因試劑盒測定熒光素酶活性，計算相對熒光素酶活性值。

結(jié) 果

1.喉癌組織中miR-9-5p及FRMD6的表達(dá)：分別提取32例患者及對應(yīng)癌旁組織樣本總RNA并反轉(zhuǎn)錄得cDNA，RT-PCR結(jié)果如圖1所示，與對照比較，喉癌組織中miR-9-5p表達(dá)顯著增加(圖1A)，而FRMD6在喉癌組織中表達(dá)下降(圖1B)。以上結(jié)果提示，miR-9-5p和FRMD6在人喉癌組織中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 miR-9-5p在人喉癌組織及Hep2細(xì)胞中表達(dá)
A.喉癌組織中miR-9-5p表達(dá)；B.喉癌組織中FRMD6表達(dá)

2.miR-9-5p與FRMD6對喉癌Hep2細(xì)胞增殖及凋亡的影響：如圖2A所示，miR-9-5p 抑制劑轉(zhuǎn)染Hep2細(xì)胞，RT-PCR結(jié)果顯示抑制效果良好。將對照抑制劑、miR-9-5p抑制劑、FRMD6過表達(dá)載體、miR-9-5p抑制劑+FRMD6過表達(dá)質(zhì)粒分別瞬轉(zhuǎn)入Hep2細(xì)胞，依次在1、2、3、4、5天收集細(xì)胞測定A570值，MTT分析結(jié)果表明，與對照組比較miR-9-5p抑制劑顯著抑制Hep2細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，F(xiàn)RMD6過表達(dá)后同樣抑制了Hep2細(xì)胞增殖(P<0.05)，而miR-9-5p抑制劑+FRMD6過表達(dá)共轉(zhuǎn)后抑制效率顯著高于單轉(zhuǎn)染(P<0.05,圖2B)。細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，miR-9-5p 抑制劑及FRMD6過表達(dá)組Hep2細(xì)胞的增殖率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且miR-9-5p抑制劑+FRMD過表達(dá)組細(xì)胞增殖活力抑制效果最為明顯(P<0.05，圖2C)。此外caspase-3活性分析結(jié)果顯示，miR-9-5p 抑制劑+FRMD6過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率較單轉(zhuǎn)染組顯著升高(P<0.05，圖2D)。以上結(jié)果表明，miR-9-5p過表達(dá)對喉癌細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，下調(diào)miR-9-5p則抑制細(xì)胞的存活率，且過表達(dá)FRMD6能增加這種抑制效率，此結(jié)果提示FRMD6可能在喉癌組織及Hep2細(xì)胞中拮抗miR-9-5p。

圖2 miR-9-5p影響Hep2細(xì)胞增殖活力
A.miR-9-5p inhibitor瞬轉(zhuǎn)Hep2細(xì)胞RT-PCR結(jié)果；B.miR-9-5p 抑制劑瞬轉(zhuǎn)Hep2細(xì)胞FRMD6表達(dá)情況；C、D.MTT法與細(xì)胞克隆形成實驗；E. caspase-3蛋白活性檢測。與對照抑制劑比較，*P<0.05，**P<0.01,ΔP<0.05,#P<0.01。

3.miR-9-5p直接靶向調(diào)控FRMD6表達(dá)：如圖3所示，在micoRNA數(shù)據(jù)庫targetscan中預(yù)測得到1個可能與miR-9-5p結(jié)合的FRMD63′-UTR位點，同時設(shè)計了突變的結(jié)合位點作陰性對照(圖3A)。在Hep2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9-5p陰性及陰性對照，RT-PCR結(jié)果顯示與陰性對照比較，Hep2細(xì)胞中miR-9-5p過表達(dá)效果良好(圖3B)，Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)后FRMD6表達(dá)受抑制(圖3C)。將前面構(gòu)建的熒光素酶報告基因載體pcDNA3.1-luci/FRMD6 3′-UTR分別與陰性對照、miR-9-5p陰性共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞檢測熒光素酶活性，結(jié)果顯示與陰性對照比較，僅有miR-9-5p陰性與FRMD6 wt 3′-UTR有結(jié)合(圖3D)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)RMD6是miR-9-5p的靶基因，F(xiàn)RMD6表達(dá)受其直接調(diào)控。

圖3 miR-9-5p直接靶向調(diào)控FRMD6表達(dá)
A.MiroRNA數(shù)據(jù)庫搜索獲得一個FRMD6 3′-UTR可能與miR-9-5p直接結(jié)合的位點；B、C.miR-9-5p陰性瞬轉(zhuǎn)Hep2細(xì)胞RT-PCR及Western blot法檢測結(jié)果；D.Luciferase雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?；與陰性對照比較，**P<0.005

4.miR-9-5p/FRMD6調(diào)控喉癌細(xì)胞增殖與Hippo信號通路：在miR-9-5p陰性/抑制劑Hep2細(xì)胞中檢測YAP表達(dá)情況。過表達(dá)miR-9-5p后抑制FRMD6，且促進(jìn)YAP的轉(zhuǎn)錄和翻譯(圖4A、B)；而抑制miR-9-5p后FRMD6表達(dá)上調(diào)，同時YAP表達(dá)上調(diào)(圖4C、D)。

圖4 miR-9-5p/FRMD6調(diào)控喉癌細(xì)胞增殖與Hippo信號相關(guān)
A.Hep2細(xì)胞過表達(dá)miR-9-5p后RT-PCT及Western blot法檢測；B.Hep2細(xì)胞抑制miR-9-5p后RT-PCT及Western blot法檢測

討 論

FRMD 6屬于Hippo信號通路上游因子，一般通過磷酸化該通路的關(guān)鍵因子MST、LATS等激活Hippo信號，控制細(xì)胞增殖凋亡[13]。有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)FRMD 6可抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖，而敲除則誘導(dǎo)乳腺上皮腫瘤細(xì)胞獲得侵襲遷移的能力，但關(guān)于FRMD6在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的作用仍知之甚少[14]。研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)在各種腫瘤包括喉癌等頭頸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成中扮演了重要角色，提示miRNA可能作為喉癌的生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)，在喉癌的早期診斷、治療、預(yù)后等方面具有潛在的臨床價值[16～18]。

然而，目前喉癌中的差異miRNA 對喉癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機制尚未完全闡明。本研究前期利用miRNA基因芯片技術(shù)對4例喉癌及癌旁組織進(jìn)行表達(dá)分析，首次發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在癌組織的表達(dá)高于癌旁組織。本研究通過RT-PCR對32例喉癌及癌旁組織中的miR-9-5p進(jìn)行驗證并檢測FRMD6的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在癌組織表達(dá)高于癌旁組織，而FRMD6則是顯著低于癌旁組織(圖1)，提示miR-9-5p高表達(dá)及FRMD6受抑制可能與喉癌癌變過程相關(guān)。為了進(jìn)一步研究miR-9-5p、FRMD6與喉癌的關(guān)系，本研究以喉癌Hep2細(xì)胞為模型，采用MTT、細(xì)胞克隆形成及caspase-3活性檢測等體外細(xì)胞實驗探討miR-9-5p及FRMD6對喉癌Hep2細(xì)胞存活的影響，結(jié)果表明抑制miR-9-5p后FRMD6表達(dá)上調(diào)；此外抑制miR-9-5p或過表達(dá)FRMD6均可以抑制喉癌細(xì)胞Hep2細(xì)胞的增殖活力，增加細(xì)胞凋亡，同時抑制miR-9-5p并過表達(dá)FRMD6則加重增殖抑制效果及細(xì)胞凋亡率(圖2)，以上提示miR-9-5p在喉癌中可能發(fā)揮著類似癌基因的功能，與FRMD6的功能拮抗，且調(diào)節(jié)FRMD6的表達(dá)。為驗證miR-9-5p作用Hep2細(xì)胞的分子機制是否通過靶向調(diào)控FRMD6基因，本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測FRMD6基因3′-UTR具有miR-9-5p結(jié)合位點。本研究通過luciferase實驗證明miR-9-5p能使FRMD6 3′-UTR熒光素酶的活性顯著性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明miR-9-5p直接靶向FRMD6 3′-UTR調(diào)控基因表達(dá)(圖3)。

Hippo信號通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條在進(jìn)化上具有保守功能的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。它在調(diào)控器官大小、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。分子機制研究發(fā)現(xiàn)，該通路接受多種上游信號，如G蛋白偶聯(lián)受體信號、機械壓力信號等，通過其核心激酶鏈作用于下游效應(yīng)蛋白YAP/TAZ進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮各種生物學(xué)功能[18，19]。FRMD6一般可通過逐級磷酸化MST1/2等基因以活化Hippo通路，抑制下游效應(yīng)基因YAP/TAZ表達(dá)從而控制細(xì)胞增殖凋亡。關(guān)于miR-9-5p靶向FRMD6調(diào)控喉癌細(xì)胞增殖凋亡與Hippo通路是否相關(guān)，本研究在miR-9-5p陰性/抑制劑 Hep2細(xì)胞中檢測YAP表達(dá)情況，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-9-5p后抑制FRMD6，同時YAP的表達(dá)上調(diào)；而抑制miR-9-5p后FRMD6表達(dá)上調(diào)，同時抑制YAP表達(dá)(圖4)。以上結(jié)果提示，miR-9-5p下調(diào)FRMD6促進(jìn)喉癌細(xì)胞增殖可能通過抑制Hippo信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證明miR-9-5p通過下調(diào)FRMD6表達(dá)促進(jìn)人喉癌Hep2細(xì)胞的增殖存活，這個過程可能存在Hippo信號通路參與。以上結(jié)果為喉癌的生物學(xué)標(biāo)志物或治療靶標(biāo)在喉癌的早期診斷、治療、預(yù)后等方面提供潛在的臨床價值。