AR和SKP2在三陰性乳腺癌中的表達及臨床意義

劉 娟 鄭唯強

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是ER、PR、HER-2均陰性表達的一組乳腺癌亞型，約占浸潤性乳腺癌的10%～20%，屬于高度異質性腫瘤，具有發病年齡小、侵襲性強、復發率高、臨床分期高、組織學級別高等臨床病理特征，在完成聯合化療后的前3～5年復發轉移風險高，主要為肺、肝、腦等重要器官的轉移[1]。由于缺乏受體的表達，內分泌治療及靶向治療對TNBC均無明顯療效，相對于其他類型的浸潤性乳腺癌，TNBC具有更差的預后，因此成為乳腺癌研究領域的熱點和難點。

雄激素受體(androgen receptor，AR)在正常乳腺組織和乳腺癌組織均廣泛表達，在ER陽性的乳腺癌，AR陽性表達顯示較好的預后；但在ER陰性乳腺癌組，AR表達與預后的關系存在爭議。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，SKP2)在浸潤性乳腺癌中高表達，且與較差的預后相關，但在TNBC中研究甚少。雄激素雙氫睪酮和SKP2的結合與增加P27的降解有關，這說明了SKP2與性激素存在一定的關系，但是否與AR表達狀態有關還不清楚。基于以上原因，本研究旨在分析TNBC中AR、SKP2表達與不同臨床病理特征的關系，同時對兩者進行相關性分析，以期為尋找TNBC的治療新靶點提供理論基礎。

材料與方法

1.標本來源：收集筆者醫院2010～2015年病理確診為TNBC并具有完整臨床病理資料的石蠟標本96例，同時選取35例乳腺良性病變(乳腺腺病、纖維腺瘤)做為對照。所有病例均重新調閱檔案資料，由高年資病理醫師復核切片。所有標本均經4%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片并HE染色。在納入本實驗的TNBC樣本中，隨機選取20例對應的新鮮腫瘤組織及5例距腫瘤組織>5cm的癌旁乳腺組織。所有新鮮標本均在病變組織離體30min內取材，凍存于-80℃冰箱備用。納入本實驗的TNBC具體標準如下：①所有病例都需具有完整的臨床病理資料；②所有患者均為初診手術；③術后病理確診為TNBC；④術前未行任何內分泌治療或新輔助化療。

2.主要試劑：組織芯片預鑄蠟塊購于UNITMA公司；鼠抗人單克隆抗體AR(克隆號AR441)購于基因公司，兔抗人單克隆抗體SKP2[克隆號EPR3305(2)]購于英國Abcam公司，PrimeScriptTM RT reagent Kit(for real-time)反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

3.方法：(1)免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)技術是利用抗原抗體特異性結合的原理對組織細胞內的蛋白進行定性、定位或半定量的研究，該技術組織形態學保存完整，蛋白定位直觀清晰，在進行形態與功能相結合的研究時具有重要意義；石蠟包埋標本能長期保存，連續切片。因此筆者對96例TNBC及35例良性乳腺病變的石蠟包埋標本采用了IHC法檢測AR、SKP2的蛋白表達情況：1)為避免傳統石蠟切片進行IHC時出現的費時費力、染色結果存在批次時間誤差等缺點，本實驗將所有納入的石蠟包埋標本制成組織芯片。根據HE切片選取1～2個典型的腫瘤區域，在原始蠟塊上標記相應的打孔位置。構建10×6的微陣列設計圖，在原始蠟塊的標記位置鉆取直徑2mm的組織芯1～2 條，嚴格按照微陣列設計圖包埋組織芯。將組織芯片以3μm厚度連續切片，裱于涂膠玻片備用。2)按照IHC中的Envision兩步法檢測AR、SKP2。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知AR陽性的睪丸組織和Skp2陽性的腎透明細胞癌作陽性對照。(2)Western blot法是對組織細胞內提取的蛋白凝膠電泳處理后，用特異性的抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質定量檢測技術。本實驗對20例新鮮TNBC及5例對照癌旁組織采用Western blot法檢測組織內AR、SKP2蛋白的表達情況：①取50mg凍存組織剪細后RIPA冰浴下勻漿，低溫高速離心后取上清液，BCA法測定蛋白濃度；②取等量蛋白水煮變性后依次恒壓電泳、轉膜；③脫脂奶粉封閉，滴加一抗(AR 1∶200； SKP2 1∶1000)、二抗，搖床孵育，ECL顯色;④暗室曝光，掃描成像。內參為GAPDH。(3)RT-PCR是以mRNA反轉錄產生的cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增以檢測目的基因表達水平的一種分子定量技術。本實驗擬采用該技術對20例新鮮TNBC及5例對照癌旁組織檢測AR、SKP2的mRNA表達情況：①根據NCBI網站公布人類AR、SKP2基因序列設計引物(表1)，引物由上海軼漚生物科技公司合成；②取50mg凍存組織剪細后相繼加入TRIzol、氯仿、異丙醇抽離總RNA，洗滌干燥后溶解RNA并測定濃度；③按照反轉錄試劑盒說明合成cDNA；④以cDNA為模板根據PCR試劑盒說明進行擴增。所有樣本均設3個復孔，結果取3次平均值，每次反應均設空白對照，內參為GAPDH。該實驗重復3次。

表1 RT-PCR實驗AR、SKP2引物序列

4.結果判讀：(1)免疫組化結果判讀：AR、SKP2陽性表達為定位于細胞核的棕黃色或棕褐色信號。采用H-score對染色結果進行半定量分析，總分>2分為陽性表達[2]。(2)Western blot法檢測結果判讀：根據蛋白條帶灰度顯色結果比較樣本AR、SKP2的表達。(3)RT-PCR結果判讀：根據2-△Ct觀察樣本AR、SKP2的相對表達。

5.統計學方法：實驗結果采用SPSS 20.0統計學軟件進行統計分析。AR和SKP2的組間比較采用χ2檢驗，兩者相關性分析采用Spearman等級相關分析檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.AR、SKP2蛋白在TNBC及乳腺良性病變中的表達：96例TNBC組織中AR陽性表達為18例，SKP2陽性表達為42例；35例良性乳腺病變中AR陽性表達為14例，SKP2均陰性表達(圖1、圖2)。

圖1 TNBC癌組織中AR的表達(IHC Envision法，×200)
A.陰性表達；B.陽性信號定位于胞質，為陰性表達；C.陽性信號定位于胞核和胞質，為陽性表達；D.AR弱陽性表達；E.AR中等強度表達；F.AR強陽性表達

2.AR、SKP2表達與TNBC不同臨床病理因素的相關性：在TNBC中，AR的陽性表達與淋巴結轉移狀態顯著相關(P<0.05)，無淋巴結轉移的腫瘤組AR的陽性表達率較高。AR的表達與發病年齡、腫瘤直徑、組織學級別以及脈管/神經侵犯狀態無顯著相關性(P>0.05)。SKP2的陽性表達與組織學級別、神經/脈管侵犯狀態顯著相關(P<0.05)，組織學級別較高的腫瘤組其SKP2的陽性表達率較高，有神經/脈管受累的腫瘤組SKP2的陽性表達率也較高。SKP2的表達情況與年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移狀態無相關性(P>0.05，表2)。

圖2 TNBC癌組織中SKP2的表達(IHC Envision法，×200)
A.陰性表達；B.陽性信號定位于胞質，為陰性表達；C.陽性信號定位于胞核和胞質，為陽性表達；D.SKP2弱陽性表達；E.SKP2中等強度表達；F.SKP2強陽性表達

表2 AR、SKP2表達在TNBC中與各組臨床病理因素的關系[n(%)]

臨床病理特征nAR表達情況SKP2表達情況陰性陽性χ2P陰性陽性χ2P年齡(歲) <503329(87.9)4(12.1)1.4500.22819(57.6)14(42.4)0.0360.850 ≥506349(77.8)14(22.2)35(55.6)28(44.4)腫瘤直徑(cm) <22013(65.0)7(35.0)3.1350.0779(45.0)11(55.0)1.2990.254 ≥27665(85.5)11(14.5)45(59.2)31(40.8)組織學級別 Ⅰ、Ⅱ3829(76.3)9(23.7)1.0050.31627(71.1)11(28.9)5.6000.018 Ⅲ5849(84.5)9(15.5)27(46.6)31(53.4)淋巴結轉移 無4834(70.8)14(29.2)6.8380.00927(56.2)21(43.8)0.0001.000 有4844(91.7)4(8.3)27(56.2)21(43.8)神經/脈管侵犯 無8066(82.5)14(17.5)0.1230.72649(61.3)31(38.8)4.8760.027 有1612(75.0)4(25.0)5(31.2)11(68.8)

3.AR、SKP2在TNBC及良性乳腺病的表達：在35例良性乳腺病變組織中AR的陽性率為40.0%，在96例TNBC組織中AR的陽性率為18.8%，其陽性表達率相對較低(P<0.05)。SKP2在35例良性乳腺病變組織中均陰性表達，在96例TNBC中的陽性率為43.8%，其陽性表達率差異有統計學意義(P<0.05,表3)。

表3 AR、SKP2表達在TNBC和纖維腺瘤/腺病的關系[n(%)]

4.對AR、SKP2表達在TNBC中的相關性分析：經Spearman相關性分析，AR與SKP2在TNBC中顯著相關(r=0.222，P=0.030,表4)。

5.Western blot法檢測AR、SKP2蛋白在TNBC及癌旁乳腺組織的表達：20例TNBC中AR、SKP2高表達的各8例，AR、SKP2共同高表達的為3例；5例癌旁乳腺組織有3例AR高表達，SKP2 均弱表達或不表達(圖3)。

表4 AR、SKP2表達在TNBC中相關性分析[n(%)]

圖3 Western blot法檢測顯示TNBC癌旁乳腺組織及癌組織AR、SKP2蛋白表達
樣本編號48P、90P、97P、11P、74P為對照組癌旁乳腺組織，其余為實驗組TNBC癌組織

6.RT-PCR檢測AR、SKP2 mRNA在TNBC及癌旁乳腺組織的表達：20例TNBC中AR、SKP2高水平表達的組織均為8例，其中AR、SKP2共同高表達的組織有3例；5例癌旁乳腺組織有3例AR高水平表達，SKP2均低水平表達(圖4、圖5)。

圖4 RT-PCR顯示AR基因在TNBC癌旁乳腺組織及癌組織的相對表達

圖5 RT-PCR顯示SKP2基因在TNBC癌旁乳腺組織及癌組織的相對表達

經檢驗上述3種不同實驗方法從蛋白水平、分子水平對TNBC組織的AR、SKP2檢測結果基本一致。

討 論

在過去的幾十年里，TNBC的治療方案進展甚微，目前主要的治療方案仍為常規化療，但療效常常不佳，仍易發生早期復發和遠處轉移，針對TNBC進行更精準的個性化治療至關重要，因此尋找新的治療靶點也成為TNBC研究領域的熱點和難點。

AR屬于類固醇激素受體家族的成員，是配體依賴性的反式轉錄調節蛋白，基因編碼位于Xq11.12，相對分子質量為110000，具有4個獨特功能域：① 與轉錄激活相關的氨基末端結構域(NTD)，即配體獨立激活功能域；②DNA結合域(DBD)，由2個Zn2+和8個半胱氨酸形成一對與雄激素反應元件相互作用的鋅指構成；③配體結合域(LBD)，為受體與激素結合的區域；④鉸鏈區(flexible hinge)，為連接DNA結合域與配體結合域，調控核定位。未結合配體的AR以非激活形式存在于細胞質，與熱休克蛋白HSP70與90形成復合物；與配體結合的AR則發生構象變化而活化，與熱休克蛋白解離，轉位至細胞核，與雄激素反應元件(ARE)相結合，同時與其他轉錄因子相互作用，調控下游靶基因的轉錄與翻譯，從而實現雄激素對靶細胞的調控。若AR缺失，則雄激素對組織無刺激反應。

在ER陽性的乳腺癌，AR的陽性表達常常顯示更好的預后[3]。但在ER陰性的乳腺癌，尤其是TNBC，AR與預后的關系存在較大的爭議。有研究表明，AR的陽性表達顯示更差的預后[4]；也有研究提示AR表達與預后無明顯相關，各臨床病理特征在AR的差異性表達下并沒有明顯區別，多數研究認為，AR陽性表達與更好的預后相關[5～7]。本研究中，AR在TNBC中的陽性表達率為18.8%，與大多數文獻報道的10%～36%相近，同時也證實了AR的陽性表達在TNBC中顯示更好的預后相關，無淋巴結轉移的TNBC中AR更易陽性表達[4,8]。

關于AR在TNBC中表達及意義，部分統計結果出現差異性的原因可能與以下幾個方面有關：①研究的樣本量相對較少；②研究對象存在差異：不同實驗室對ERα、PR、HER-2的人工判讀可能存在差異，進而導致對TNBC的篩選出現差異；③腫瘤的異質性：同一個例乳腺癌組織不同區域可能出現不同的免疫表型；④AR檢測中存在差異：測定AR存在實驗室環境、抗體種類及技術操作的不同；⑤AR陽性的cut-off值不同：不同研究對AR陽性細胞所占比例的統計數值選取不同。

在TNBC中，AR可能會模仿ERα效應成為致癌因子，刺激腫瘤的增殖[9]； AR陽性的TNBC通常攜帶PI3KCA突變，對PI3K/mTOR抑制敏感，促進乳腺癌細胞的增殖[10]；同時通過磷酸化AKT作用的AR磷酸化可以消除AR誘導的凋亡效應，促進腫瘤的發展。以上可能是AR在TNBC陽性表達顯示更差預后的原因，為采用AR作為TNBC治療新靶位提供了理論依據。也有研究表明，AR的陽性表達可誘導PTEN抑制PI3KCA的激活，同時PTEN與蛋白killing作用可誘導P53、P73表達增加，導致乳腺癌細胞生長抑制和凋亡增加，因此AR在TNBC中的抗增殖作用可能是AR陽性的TNBC患者顯示較好預后的原因[11]。總體說來，由于TNBC發病機制的復雜性，AR信號通路與其他信號通路在TNBC中存在復雜的交互作用，這些都可能是AR在TNBC的表達與預后關系的研究出現差異性結果的原因。

由于TNBC缺乏明確的內分泌或靶向治療的受體，但卻有約1/3的TNBC患者顯示AR的陽性表達，且在不同亞型的TNBC中AR的表達與預后存在明顯差異，因此參照AR抑制劑應用于前列腺癌的治療研究，在乳腺癌研究領域涌現了大量關于AR抑制劑應用于TNBC的研究。其中研究較多的是比卡魯胺、恩雜魯胺、阿比特龍，多項實驗證明AR抑制劑在AR+的TNBC中能有效地抑制腫瘤細胞的增殖，增加細胞凋亡，減緩疾病進程[12]。總之這些研究都不同程度地指出了針對AR的靶向藥物在改善TNBC預后方面的積極意義，因此AR也可能成為TNBC的潛在治療靶點，雖然AR在TNBC中的具體作用機制還有待進一步研究，但這仍為尋找治療TNBC新途徑提供了新思路。

S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，SKP2)是泛素蛋白連接酶復合物SCF(SKP1-Cullin1-F-box)中的一種F-box蛋白亞基，其基因編碼位于5p13，相對分子質量約為47000。SKP2作為泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)中是一種重要的調節因子，介導泛素連接酶(E3)對磷酸化的底物(主要是CKI，如P21、P27、P57等多種細胞周期蛋白)進行特異性識別，進而底物被蛋白酶體迅速降解。SKP2在細胞周期的G0/G1期幾乎不表達，S期表達增加，在細胞的增殖、凋亡以及細胞正常周期進程中發揮關鍵調控作用。SKP2的過表達會引發泛素蛋白酶途徑對CKI的降解增強，導致P27、P57等周期抑制蛋白的降低，進而對G1/S調控點的抑制作用減弱，細胞增殖加速及分化紊亂，因此SKP2屬于一種原癌基因，它的激活能夠導致腫瘤的發生。

SKP2高表達與許多惡性腫瘤的發生、進展密切相關。Fagan-Solis等[13]發現SKP2在浸潤性乳腺癌中顯著高表達，ERα陰性的乳腺癌中SKP2陽性率高于ERα陽性的乳腺癌；ERα陰性的乳腺癌中，TNBC中SKP2的表達率比非TNBC的表達率更高。Meta分析提示SKP2的表達與預后呈負相關，SKP2的高表達使腫瘤更具侵襲性，是乳腺癌不良預后的獨立因素[14]。研究指出SKP2在乳腺上皮細胞中具有致癌潛能，在ERα陰性的乳腺癌中的表達與腫瘤的分級、細胞周期調控基因的表達呈正相關[15]。在浸潤性乳腺癌中細胞系實驗也證實了SKP2能抑制細胞凋亡，改變細胞周期分布狀態，誘導S期細胞增多，從而促進乳腺癌細胞的增殖[16]。關于SKP2在TNBC中表達的研究較少，筆者的研究結果顯示SKP2在TNBC的陽性表達率為43.8%，顯著高于良性對照組，SKP2的表達與預后呈負相關，在組織學級別較高、有脈管/神經累犯的TNBC中SKP2的陽性表達率較高。體外細胞系實驗證實SKP2抑制劑可誘導乳腺癌細胞的凋亡，抑制其增殖、侵襲及遷移，因此SKP2在TNBC中的高表達使其有可能成為TNBC的潛在治療新靶點及評價預后新指標[17]。

在乳腺癌和卵巢癌中，SKP2可扮演雄激素雙氫睪酮受體的角色，兩者結合后直接作用于P27，導致P27降解增加，這一過程與底物P27是否磷酸化的狀態無關。在去勢抵抗的前列腺癌中，SKP2與AR顯示正相關，SKP2的高表達可增加AR的轉錄及表達活性[18]。以上研究都表明SKP2與雄激素、AR存在一定的關系，在TNBC中關于AR、SKP2關系的研究甚少，筆者的實驗結果顯示AR和SKP2在TNBC中存在正相關，提示AR、SKP2在TNBC中的表達可能同受某因素的影響，但兩者在TNBC中的具體關系仍需更多研究證實。

筆者采用免疫組化法、Western blot法及RT-PCR法 3種不同的實驗方法分別對AR、SKP2從基因到蛋白水平進行檢測，經驗證3種實驗方法結果基本一致；通過免疫組化對收集的所有TNBC及對照組織的檢測結果進行分析，揭示AR、SKP2在TNBC表達與各臨床病理特征的意義，同時AR、SKP2在TNBC的較高表達提示它們有可能成為評價TNBC預后的潛在新指標、治療TNBC的潛在新靶點。當然由于TNBC發病機制的復雜性，AR、SKP2在TNBC中的具體信號通路還不是很清楚，兩者在TNBC中的關系和表達特點還需要更深入的研究，相信隨著TNBC研究領域的深入拓展，會為這類患者的治療及預后帶來新希望。