去勢對白來航母雞垂體和腎上腺的影響

邵 凡，李紅偉，段金琳，李俊英，吳常信*

（1.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；2.惠州學院生命科學學院，廣東惠州 516007）

性激素是維持動物性功能和第二性征的物質，同時在參與機體蛋白質、糖類、脂質代謝中起到重要作用。在雌性動物體內，卵巢在垂體釋放的促性腺激素調控下，合成和分泌以雌二醇為主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。除了卵巢外，腎上腺是雌性動物合成雄激素的另一個主要器官。摘除雌性動物的卵巢，即去勢后，紊亂的性激素水平負反饋調節垂體，改變垂體分泌激素的水平，或直接作用于其他靶器官，共同引起機體表型變化。

雌激素應答基因GREB1 是雌激素受體調控通路中的一個關鍵的調控因子[1]，在參與哺乳動物乳腺癌的形成和細胞分化過程中起到重要作用[2]。有關GREB1 基因在調控動物其他發育過程中的作用鮮有報道，僅Li 等[3]研究發現GREB1 與斑馬魚的垂體發育有關。基于此，本研究選擇白來航母雞為實驗材料，以去勢母雞雄性化為表型，研究去勢對母雞垂體和腎上腺發育的影響，并將GREB1 作為垂體發育候選基因，檢測去勢母雞垂體GREB1 mRNA 水平相對表達量，旨在為進一步研究性腺對下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 本研究中采用的白來航母雞來自于中國農業大學家禽遺傳資源與育種試驗基地。實驗組為 6 只于 9 周齡摘除卵巢的白來航母雞，對照組為 6只未摘除卵巢的同日齡母雞。飼養至97 周齡時屠宰，測量冠高、距長、腎上腺重和垂體重，并將垂體組織保存于液氮中。

1.2 血清雌二醇和睪酮濃度測定 上午靜脈采血。采血前限飼12 h，每只雞采 2 份血樣，放置于4℃分離血清，測量血清中性激素濃度，并計算 2 份樣品的平均值作為最終激素濃度。血清激素濃度測定由北京華英生物技術研究所采用 γ-911 全自動放免計數儀、E2-17β（HY-10029）放免試劑盒以及睪酮（HY-10027）放免試劑盒完成。

1.3 垂體總RNA 提取及定量引物 試劑盒提取垂體總RNA。將垂體組織放入1 mL TRIzol 中勻漿裂解，離心取上清，加入200 μL 氯仿混勻，室溫放置3 min。離心取上清，加入300 μL 無水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱 CR3 中，之后的步驟同動物組織總RNA 提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，DP431）。

利用Primer Premier 5.0 設計GREB1 定量引物，引物序列F：5'- ACAAGACCATCGGTGTTAGGC-3'，R：5'-GGTGACCAACCTTTATGGCGT-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 統計分析 利用Prism7 軟件對數據進行分析、作圖。2 組間差異采用 t-test 分析，結果表示為平均值±標準誤。

2 結 果

2.1 去勢對母雞血清雌二醇和睪酮濃度的影響 由表1 可知，去勢母雞血清雌二醇濃度低于未去勢母雞（P＜0.01），血清睪酮濃度與未去勢組無顯著差異。

表1 去勢對母雞血清激素濃度的影響

2.2 去勢對母雞冠高、距長及腎上腺、垂體重量的影響表2 顯示，去勢母雞的冠高（P＜0.01）、距長（P＜0.01）和垂體重（P＜0.05）高于未去勢母雞，去勢母雞的腎上腺重低于未去勢母雞（P＜0.01）。

表2 去勢對母雞第二性征及垂體、腎上腺重的影響

2.3 垂體GREB1 mRNA 相對表達量 圖1 顯示，去勢母雞垂體GREB1 相對表達量低于未去勢母雞（P＜0.05）。

圖1 去勢對母雞垂體GREB1 mRNA 相對表達量

3 討 論

雌性動物的卵巢除了產生卵細胞外，還可分泌以雌二醇為主的雌激素、孕激素以及少量雄激素。本實驗中，白來航母雞摘除卵巢后，血清雌二醇濃度顯著降低，與Terada 等[4]對白來航母雞去勢的研究結果一致。Valdez等[5]摘除2 個近交系母雞的卵巢并測定54 周齡時血清性激素水平的研究顯示，卵巢摘除后，血清性激素水平的變化在2 個近交系中有相同趨勢，均為去勢母雞雌激素濃度顯著降低，雄激素濃度升高，但未達到顯著水平，與本實驗中白來航去勢母雞的血清雌二醇、睪酮濃度變化趨勢一致。卵巢摘除后，母雞血清雌激素濃度減少，雄激素濃度增加，使母雞向雄性化發育。在雌性動物體內，除了卵巢外，腎上腺貢獻了機體30%～50%的雄激素[6]。本實驗結果表明，去勢可降低母雞腎上腺重，這一結果與Kitay[7]對雌性大鼠去勢的結果一致。

垂體是機體“首要”的內分泌腺，在垂體分泌的促性腺激素刺激下，性腺分泌性激素，而摘除家禽的卵巢導致血清性激素水平紊亂，又可以負反饋調節垂體的激素分泌，引起垂體功能改變[4]。研究發現，摘除大鼠睪丸可引起垂體肥大和機能亢進[8]。本實驗發現，摘除母雞卵巢可顯著增加垂體重，與Kitay[7]對雌性大鼠去勢的結果一致。垂體有垂體前葉、垂體中葉和垂體后葉3個區域，垂體前葉包括遠側部和少量結節部，約占垂體重量的80%，在垂體分泌功能中起到主要作用。雌激素被認為可以使垂體前葉細胞快速凋亡[9]，這也是本實驗中母雞去勢后垂體重量增加的原因。

SIX 同源蛋白家族、WNT/β-catenin 和Notch 信號通路以及SOX 轉錄因子等在垂體形成和功能維持過程中可能起到調控作用[10]。近年，Li 等[3]發現，雌激素受體調控通路中一個早期的應答基因GREB1 參與斑馬魚的垂體發育，GREB1 被發現與多種細胞分化能力有關，其表達量受到雌激素正向調控[11-12]。因此，本實驗結果表明，去勢母雞垂體GREB1 mRNA 水平表達量顯著低于正常母雞，且垂體GREB1 表達量與垂體重量呈負相關。

4 結 論

在去勢母雞雄性化過程中，垂體和腎上腺發揮了重要作用。母雞去勢后，血清雌二醇濃度和腎上腺重量降低，垂體重量增加，與垂體發育相關的基因GREB1 表達量下降，這一結果為研究雌激素受體介導的垂體發育提供參考。腺體重量的改變將會引起腺體功能改變，去勢后垂體、腎上腺中基因表達的變化還需進一步研究。